Pipetty電動(dòng)移液器在克羅諾桿菌定量檢驗(yàn)中的應(yīng)用

方案摘要：本方案建立基于Pipetty電動(dòng)移液器的克羅諾桿菌定量檢驗(yàn)方法，以最大可能數(shù)（MPN）法為核心，結(jié)合選擇性增菌、特異性分離及生化鑒定技術(shù)實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量。方案核心整合Pipetty電動(dòng)移液器高精度移液優(yōu)勢(shì)，搭配RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀，優(yōu)化樣品稀釋、培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移及菌落接種等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，顯著降低人為誤差。檢驗(yàn)流程遵循“BPW前增菌- mLST-Vm選擇性富集-顯色培養(yǎng)基分離-TSA純化-生化/PCR確證”標(biāo)準(zhǔn)化步驟，最終依據(jù)不同稀釋度陽(yáng)性管數(shù)查MPN檢索表，報(bào)告100g（mL）樣品中目標(biāo)菌MPN值。該方法為食品等領(lǐng)域克羅諾桿菌污染防控提供高效可靠的檢驗(yàn)技術(shù)支持。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
      克羅諾桿菌定量檢驗(yàn)基于 MPN（最大可能數(shù)）法原理，結(jié)合選擇性增菌、特異性分離及精準(zhǔn)鑒定實(shí)現(xiàn)定量。先以 BPW 培養(yǎng)基前增菌，為少量目標(biāo)菌提供生長(zhǎng)環(huán)境；再用 mLST-Vm 選擇性培養(yǎng)基抑制雜菌、富集目標(biāo)菌。借助顯色培養(yǎng)基分離可疑菌落，挑取后經(jīng) TSA 純化，通過(guò)生化反應(yīng)驗(yàn)證典型特征，可選 PCR 靶向 ITS 區(qū)域確認(rèn)。最終依據(jù)不同稀釋度陽(yáng)性管數(shù)查 MPN 檢索表，報(bào)告 100g (mL) 樣品中目標(biāo)菌 MPN 值。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty 電動(dòng)移液器；
② 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃士1 ℃,41.5 ℃±1℃；
③ 冰箱:2 ℃~5 ℃,-20 ℃；
④ 恒溫水浴箱:41.5 ℃±1℃；
⑤ 天平:感量 0.1g、0.01g；
⑥ 振蕩器；
⑦ 無(wú)菌容器:容量 100mL、200mL、2000 mL；
⑧ 無(wú)菌培養(yǎng)皿:直徑90mm；
⑨ pH 計(jì)或 pH 比色管或精密 pH 試紙；
⑩ 微生物生化鑒定系統(tǒng)；
⑪ PCR儀；
⑫ 離心機(jī):轉(zhuǎn)速≥12000r/min；
⑬ 凝膠成像系統(tǒng)或紫外檢測(cè)儀；
⑭ 瓊脂糖水平電泳儀或毛細(xì)管電泳儀；
⑮ PCR反應(yīng)管；
⑯ RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀；
 
2、試劑和材料
① 緩沖蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)；
② 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium,mLST-Vm)；
③ 克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基；
④ 胰蛋白胨大豆瓊脂(trypticase soy agar,TSA)；
⑤ 生化鑒定試劑盒；
⑥ 氧化酶試劑；
⑦ L-賴(lài)氨酸脫羧酶培養(yǎng)基；
⑧ L-鳥(niǎo)氨酸脫羧酶培養(yǎng)基；
⑨ L-精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基；
⑩ 糖類(lèi)發(fā)酵培養(yǎng)基；
⑪ 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基；
⑫ 克羅諾桿菌質(zhì)控菌株；
⑬ 大腸埃希氏菌質(zhì)控菌株；
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、取檢樣 100 g(mL)、10 g(mL)、1 g(mL)各3份,分別置無(wú)菌容器中,分別加入 900mL、90mL、9mL已預(yù)熱至 41 ℃±1 ℃的BPW,用手緩緩地?fù)u動(dòng)至檢樣充分溶解,制成1∶10樣品勻液,36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 18 h±2 h。輕輕搖動(dòng)混勻培養(yǎng)過(guò)的前增菌液,分別移取1mL,轉(zhuǎn)入 10 mL mLST-Vm 肉湯，41.5 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h±2 h。
2、分離培養(yǎng)
① 提前使用RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀制備克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基平板，設(shè)置分裝體積20mL/皿，確保培養(yǎng)基厚度4mm±0.2mm，滅菌后冷卻至45℃以下，自動(dòng)分裝至培養(yǎng)皿中，凝固后備用�；靹� LST-Vm 肉湯培養(yǎng)物，用 Pipetty 電動(dòng)移液器精準(zhǔn)吸取 10μL培養(yǎng)物。將吸取的培養(yǎng)物分別劃線(xiàn)接種于2個(gè)克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基平板。36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h。
 
② 按顯色培養(yǎng)基判定標(biāo)準(zhǔn)挑取可疑菌落，每個(gè)平板至少挑 5 個(gè)（不足則全挑），用 Pipetty輔助接種，分別劃線(xiàn)接種 TSA 平板，36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h 備用。
3、確證實(shí)驗(yàn)：將可疑菌落接種 TSA平板后進(jìn)行生化鑒定�？梢允紫辱b定克羅諾桿萌顯色培養(yǎng)基平板上最具特征性的菌落接種的 TSA 平板上的菌落。如果是陽(yáng)性,則不需要測(cè)試其他TSA 平板上的菌落。如果是陰性,則選取其他 TSA 平板上的菌落進(jìn)行鑒定,直到全部為陰性或發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性菌落為止。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性,對(duì) TSA 平板上的菌落進(jìn)行鑒定時(shí),應(yīng)使用新鮮的傳代菌落�？肆_諾桿菌的主要生化特征見(jiàn)表3。
 
四、結(jié)果報(bào)告
綜合菌落特征、確證試驗(yàn)(生化鑒定)結(jié)果,根據(jù)檢出克羅諾桿菌的陽(yáng)性管數(shù),查 MPN檢索表,報(bào)告 100 g(mL)樣品中克羅諾桿菌的 MPN 值。