Pipetty電動(dòng)移液器在克羅諾桿菌定性檢驗(yàn)中的應(yīng)用

方案摘要：本方案整合 Pipetty 電動(dòng)移液器與 RAYPA 培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。流程涵蓋增菌培養(yǎng)、分離培養(yǎng)、 PCR 鑒定及生化確證試驗(yàn)：RAYPA 儀器實(shí)現(xiàn) BPW、LST-Vm 肉湯等培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)化制備與精準(zhǔn)分裝，保障培養(yǎng)基成分均勻、體積一致；Pipetty 電動(dòng)移液器貫穿移液、接種、PCR 反應(yīng)體系配制等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，提升微升級(jí)操作精度。通過(guò)自動(dòng)化儀器替代部分手動(dòng)操作，減少人為誤差與污染風(fēng)險(xiǎn)，增強(qiáng)檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，同時(shí)提升整體檢測(cè)效率。最終結(jié)合菌落特征、生化鑒定及可選 PCR 結(jié)果，精準(zhǔn)報(bào)告 100g (mL) 樣品中克羅諾桿菌的檢出情況，為食品微生物安全檢測(cè)提供高效可靠的技術(shù)方案。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
       克羅諾桿菌定性檢驗(yàn)核心是 “富集 - 篩選 - 驗(yàn)證 - 確證” 的遞進(jìn)邏輯。先以 BPW 培養(yǎng)基前增菌富集目標(biāo)菌，再用 LST-Vm 肉湯選擇性增菌抑制雜菌、擴(kuò)增目標(biāo)菌。通過(guò)克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基的特異性顯色反應(yīng)，篩選出可疑菌落�？蛇x PCR 鑒定利用特異性引物，靶向擴(kuò)增目標(biāo)菌 282bp 特征基因片段，實(shí)現(xiàn)分子層面快速驗(yàn)證。最終通過(guò)生化鑒定，依據(jù)克羅諾桿菌獨(dú)特的代謝生化特征，排除假陽(yáng)性，確證菌株身份，最終判定樣品中是否存在該菌。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty 電動(dòng)移液器；
② 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃士1 ℃,41.5 ℃±1℃；
③ 冰箱:2 ℃~5 ℃,-20 ℃；
④ 恒溫水浴箱:41.5 ℃±1℃；
⑤ 天平:感量 0.1g、0.01g；
⑥ 振蕩器；
⑦ 無(wú)菌容器:容量 100mL、200mL、2000 mL；
⑧ 無(wú)菌培養(yǎng)皿:直徑90mm；
⑨ pH 計(jì)或 pH 比色管或精密 pH 試紙；
⑩ 微生物生化鑒定系統(tǒng)；
⑪ PCR儀；
⑫ 離心機(jī):轉(zhuǎn)速≥12000r/min；
⑬ 凝膠成像系統(tǒng)或紫外檢測(cè)儀；
⑭ 瓊脂糖水平電泳儀或毛細(xì)管電泳儀；
⑮ PCR反應(yīng)管；
⑯ RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀；
 
2、試劑和材料
① 緩沖蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)；
② 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium,mLST-Vm)；
③ 克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基；
④ 胰蛋白胨大豆瓊脂(trypticase soy agar,TSA)；
⑤ 生化鑒定試劑盒；
⑥ 氧化酶試劑；
⑦ L-賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基；
⑧ L-鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基；
⑨ L-精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基；
⑩ 糖類發(fā)酵培養(yǎng)基；
⑪ 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基；
⑫ 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(its)PCR引物；
⑬ 5U/μL 耐熱 DNA 聚合酶。
⑭ 2.5mmol/dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP、25mmol/L MgCl₂；
⑮ 10×PCR 緩沖液、DNA 提取試劑、商品化 PCR 反應(yīng)預(yù)混液；
⑯ 克羅諾桿菌質(zhì)控菌株；
⑰ 大腸埃希氏菌質(zhì)控菌株；
⑱ 核酸染色劑；
⑲ 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):100 bp DNA ladder。
⑳ 50×TAE電泳緩沖液、6×DNA加樣緩沖液。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、用 RAYPA 培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀，按配方精準(zhǔn)制備 BPW 培養(yǎng)基并預(yù)熱至 41℃±1℃，通過(guò)儀器自動(dòng)分裝 900mL至無(wú)菌容器中。取100g (mL)檢樣加入 BPW容器，搖勻，36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h 完成前增菌。用 Pipetty 電動(dòng)移液器精準(zhǔn)移取1mL前增菌液，轉(zhuǎn)入由RAYPA提前制備并分裝的10ml LST-Vm肉湯管中。41.5℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h，完成選擇性增菌。
 
2、分離培養(yǎng)
① 混勻 LST-Vm 肉湯培養(yǎng)物，用 Pipetty 電動(dòng)移液器精準(zhǔn)吸取 10μL 培養(yǎng)物。將吸取的培養(yǎng)物分別劃線接種于2個(gè)克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基平板。平板由 RAYPA提前自動(dòng)制備，保證培養(yǎng)基厚度均勻、成分穩(wěn)定，提升菌落生長(zhǎng)一致性。36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h。
 
② 按顯色培養(yǎng)基判定標(biāo)準(zhǔn)挑取可疑菌落，每個(gè)平板至少挑 5 個(gè)（不足則全挑），用 Pipetty輔助接種，分別劃線接種 TSA 平板，36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h 備用。
3、PCR鑒定
① 從TSA平板挑 2-3 個(gè)可疑菌落至 500μL 滅菌去離子水中，混勻后 100℃加熱 10min，冰浴冷卻至室溫。12000r/min 離心 10min，取上清液作為 DNA 模板。
② 引物：見表1。
 
② 反應(yīng)體系：使用 Pipetty 電動(dòng)移液器連續(xù)分液模式，按表 2 比例精準(zhǔn)移取各組分，加入到PCR反應(yīng)管中，使用電機(jī)代替人工操作，可有效避免人為誤差，確保反應(yīng)體系濃度均一，提升擴(kuò)增重復(fù)性。
 
③ 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5min；94℃變性 30s、61℃退火 30s、72℃延伸 30s（35 個(gè)循環(huán)）；72℃延伸 5min，4℃保存。
3、每次 PCR 鑒定時(shí)使用克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 DNA 模板作為陽(yáng)性對(duì)照,大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA 模板作為陰性對(duì)照,提取過(guò)程設(shè)置滅菌去離子水作為 DNA 提取空白對(duì)照,PCR 反應(yīng)需另設(shè)滅菌去離子水作為 PCR 反應(yīng)體系空白對(duì)照。
4、用1×TAE電泳緩沖液制備含核酸染色劑的1.5%瓊脂糖電泳凝膠。在電泳槽中加入電泳緩沖液,使液面沒(méi)過(guò)膠面。將適量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與6×加樣緩沖液混合后點(diǎn)樣,其中第1孔加入 100 bp DNA ladder。電壓的設(shè)置根據(jù)公式--電泳槽正負(fù)極的距離(cm)X5 V/cm計(jì)算并設(shè)置,電泳時(shí)間為 20 min~30 min。使用凝膠成像系統(tǒng)或紫外檢測(cè)儀觀察和記錄結(jié)果。也可采用毛細(xì)管電泳儀等設(shè)備進(jìn)行電泳。
5、PCR鑒定結(jié)果判定
質(zhì)控系統(tǒng):陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶,陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)預(yù)期大小(282bp)的擴(kuò)增條帶,則檢測(cè)系統(tǒng)正常。任一種對(duì)照出現(xiàn)非上述正常結(jié)果,應(yīng)重做試驗(yàn),同時(shí)排除干擾因素。
陽(yáng)性結(jié)果:在質(zhì)控系統(tǒng)正常的情況下,待測(cè)樣品出現(xiàn)預(yù)期大小(282 bp)的擴(kuò)增條帶,判定 PCR 結(jié)果為陽(yáng)性。
陰性結(jié)果:在質(zhì)控系統(tǒng)正常的情況下,待測(cè)樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小(282 bp)的擴(kuò)增條帶,判定 PCR 結(jié)果為陰性。
6、確證實(shí)驗(yàn)
自 PCR 結(jié)果陽(yáng)性的 TSA 平板上挑取菌落進(jìn)行生化鑒定，PCR 結(jié)果陰性的 TSA 平板不再進(jìn)行生化鑒定。
 
四、結(jié)果報(bào)告
根據(jù)菌落特征、PCR 鑒定結(jié)果,報(bào)告 100g(mL)樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌。