LUNA-III™細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在臺盼藍(lán)染色PBMC活力分析中的應(yīng)用

關(guān)鍵詞：LUNA-III™ 自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、PBMC、偏移校正功能、臺盼藍(lán)染色、細(xì)胞濃度與活力評估

介紹
外周血單核細(xì)胞（PBMC）在感染性疾病、自身免疫疾病和腫瘤免疫學(xué)等研究領(lǐng)域中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，確保研究結(jié)果的一致性和可重復(fù)性對于獲得可靠、精準(zhǔn)的結(jié)論也至關(guān)重要。然而，由于PBMC的特性及樣本質(zhì)量的影響，其精確計(jì)數(shù)面臨諸多挑戰(zhàn)。PBMC體積較小，邊緣不夠清晰，可能影響檢測準(zhǔn)確性。此外由于PBMC來源于血液，其分離過程中常伴有大量細(xì)胞碎片和潛在的紅細(xì)胞（RBC）污染，這些因素可能降低自動對焦性能，從而導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力測定的誤差。
       
鑒于上述限制，通常推薦使用基于熒光檢測的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，例如LUNA-FX7™自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，以提高PBMC計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。然而，在僅使用明場光學(xué)系統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)型方案中，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的PBMC計(jì)數(shù)仍具有一定挑戰(zhàn)性。為了解決這個(gè)問題，LUNA-III™自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀開發(fā)了一項(xiàng)新策略，結(jié)合焦平面偏移校正技術(shù)和優(yōu)化的細(xì)胞檢測算法，以提升檢測精度。同時(shí)使用臺盼藍(lán)（Trypan Blue, TB）等染色溶液能夠增強(qiáng)細(xì)胞邊緣的可見度，從而進(jìn)一步提高檢測準(zhǔn)確性。
       
本應(yīng)用說明將通過對比LUNA-III™自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀與LUNA-FX7™自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在 PBMC 計(jì)數(shù)和活力測定中的表現(xiàn)，以驗(yàn)證LUNA-III™在該應(yīng)用中的有效性，并證明其作為一種可靠且經(jīng)濟(jì)的解決方案的可行性。

材料和方法
人外周血經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)密度梯度離心法處理，以Histopaque-1083（Sigma，#10831）分離獲得 PBMC（外周血單核細(xì)胞）樣本。在最終洗滌后，將富含血沉棕黃層的PBMC重懸于含 1% BSA的PBS溶液中。
       
在系列稀釋測定中，PBMC以 1 至 32 倍的不同稀釋因子進(jìn)行梯度稀釋。同時(shí)，另行制備了一批用于活力測定的 PBMC 樣本，并設(shè)定理論細(xì)胞活力水平分別為0%、25%、50%、75%和100%。細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力測定采用LUNA-III™自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行，使用LUNA™細(xì)胞計(jì)數(shù)專用載片，并啟用內(nèi)置PBMC計(jì)數(shù)程序（見表 1）。
       
在上樣前，細(xì)胞樣本按 1:1 體積比與0.4%臺盼藍(lán)溶液（貨號T13001）混合。此外，同一批樣本亦用于LUNA-FX7™自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測試，以對比兩者的測定結(jié)果。
在 LUNA-III™ 上使用不同偏移水平評估 PBMC 濃度及活力
使用LUNA-III™和LUNA-FX7™在三個(gè)不同的偏移水平（0、1 和 2）下測試PBMC樣本，以驗(yàn)證其在不同濃度和活力水平下的線性關(guān)系。
       
所有偏移水平下的細(xì)胞濃度均表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性，R²值均在 0.9921 以上（圖 1A）。盡管所有偏移水平均表現(xiàn)出良好的線性，但偏移水平 2 的測量結(jié)果最接近 LUNA-FX7™ 的數(shù)據(jù)。此外，LUNA-III™ 能夠準(zhǔn)確識別并標(biāo)記 PBMC（圖 1B）。
圖1. (A) 在不同稀釋梯度的 PBMC 樣本中，LUNA-III™ 細(xì)胞計(jì)數(shù)與理論細(xì)胞濃度之間的線性關(guān)系。
(B) 使用 LUNA-III™ BF-total 模式檢測不同稀釋水平的代表性圖像。橙色圓圈標(biāo)記 LUNA-III™ 識別出的細(xì)胞，檢測到的細(xì)胞數(shù)量從左至右逐漸增加，對應(yīng)的稀釋倍數(shù)范圍為 1 至 32。
BF-total：測量細(xì)胞總數(shù)的明場細(xì)胞計(jì)數(shù)模式。
 
在三個(gè)偏移水平（0、1 和 2）下進(jìn)行細(xì)胞活力測定，并與LUNA-FX7™的活力數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析。盡管偏移水平1和2與理論活力值表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性（R² = 0.9906 和 0.9987），但僅有偏移水平2的結(jié)果與LUNA-FX7™數(shù)據(jù)高度一致（圖 2A）。偏移水平0與理論活力值的相關(guān)性較低（R² = 0.9579），且其測量結(jié)果與LUNA-FX7™存在較大偏差。在LUNA-III™系統(tǒng)中，偏移水平2對不同活力水平的活細(xì)胞與死細(xì)胞標(biāo)記最為準(zhǔn)確（圖 2B）。

圖2. (A) 比較 LUNA-III™ 在三個(gè)偏移水平（0、1 和 2）下測得的細(xì)胞活力與 LUNA-FX7™ 的測量結(jié)果。
(B) LUNA-III™ 在偏移水平 0、1 和 2 下的細(xì)胞活力標(biāo)記示例圖。紅色圓圈表示死亡細(xì)胞，綠色圓圈表示存活細(xì)胞。
*LUNA-FX7™ BF-Viability：LUNA-FX7™ 使用明場成像評估細(xì)胞活力的計(jì)數(shù)模式。

使用臺盼藍(lán)染色法進(jìn)行外周血單核細(xì)胞（PBMC）計(jì)數(shù)的局限性
盡管我們的研究結(jié)果證明了使用LUNA-III™進(jìn)行PBMC的臺盼藍(lán)染色法是有效的，但該方法在PBMC計(jì)數(shù)方面存在顯著局限性。臺盼藍(lán)染色法的一個(gè)主要問題是無法區(qū)分PBMC與污染物，如紅細(xì)胞和碎片。這可能導(dǎo)致總細(xì)胞計(jì)數(shù)的過高估算以及細(xì)胞活性的不準(zhǔn)確評估，因?yàn)槲廴疚锟赡鼙诲e(cuò)誤地計(jì)為死亡細(xì)胞。相比之下，熒光染色方法，如LUNA-FX7™等基于熒光的細(xì)胞計(jì)數(shù)器所使用的方法，通過選擇性地識別活細(xì)胞和死亡細(xì)胞，并有效排除污染物，提供更為準(zhǔn)確的評估。因此，對于可能含有紅細(xì)胞或碎片的PBMC樣本，強(qiáng)烈建議使用熒光染色方法，以確保結(jié)果的精準(zhǔn)性，特別是在細(xì)胞活性和總細(xì)胞計(jì)數(shù)要求高準(zhǔn)確度時(shí)。

結(jié)論
LUNA-III™通過集成焦平面偏移和先進(jìn)的細(xì)胞檢測算法，顯著提高了PBMC計(jì)數(shù)和活性評估的準(zhǔn)確性和精確度，其中偏移級別2的表現(xiàn)與LUNA-FX7™的高性能非常匹配。然而需要認(rèn)識到，盡管LUNA-III™提供了一種具有成本效益的解決方案，使用臺盼藍(lán)染色法仍可能面臨挑戰(zhàn)。臺盼藍(lán)染色法無法區(qū)分PBMC與污染物（如紅細(xì)胞和碎片），這可能導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)的過高估計(jì)和活性讀數(shù)的不準(zhǔn)確，因?yàn)槲廴疚锟赡鼙徽`計(jì)為死亡細(xì)胞。因此，用戶在處理PBMC樣本時(shí)必須考慮這些局限性，特別是在對活性測量要求更高精度的情況下。

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