細胞計數(shù)儀在單細胞測序中進行準(zhǔn)確計數(shù)和樣品質(zhì)量驗證的應(yīng)用優(yōu)勢
利用細胞計數(shù)儀在單細胞測序中評估細胞
概述單細胞測序技術(shù)能夠用來表征異常細胞群，分析稀有細胞和細胞圖譜網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性等。由于單細胞測序巨大的應(yīng)用潛力，目前此技術(shù)正在經(jīng)歷爆炸性增長。然而，單細胞測序需要成本和時間的大量投資。為了確保時間和資源的投資得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)回報，處理前的樣本質(zhì)量至關(guān)重要。此外，由于所有的單細胞測序方案都依賴于在處理前準(zhǔn)確定量細胞，因此準(zhǔn)確的細胞計數(shù)是非常重要的第一步。
因此，用于定量單細胞測序樣品的自動細胞計數(shù)儀必須準(zhǔn)確可靠地對所有樣品類型的細胞進行計數(shù)，包括分離的組織、分離的細胞核、全血和培養(yǎng)的細胞系。在此，我們演示了LUNA-FX7自動細胞計數(shù)儀如何為不同類型的樣品提供準(zhǔn)確的計數(shù)和樣品質(zhì)量的驗證。
單細胞測序工作流程：1) 組織收集，2) 分離細胞制備，3) 測序文庫制備，4) 測序和 5) 分析。
細胞樣本質(zhì)量評估
最初收集了兩個細胞樣本用于單細胞測序分析。兩個樣本均使用標(biāo)準(zhǔn)細胞活力方案和AO/PI細胞染色染料進行計數(shù)。第一個樣品是從人外周血中分離出的B細胞，具有高度的活力和單細胞分離度，適合下游文庫制備。
B細胞為單細胞文庫做好了充分準(zhǔn)備，包括所有陽性綠色細胞，沒有死細胞（RF）或顆粒碎片(BF)，具有100%活力。這些健康細胞的平均大小為10.7 μm，在細胞計數(shù)時濃度為3.00E+05個細胞/ml的細胞簇圖中的單細胞分離率為100%。
相比之下，第二個樣品（貼壁AsPC-1細胞）提供了一個示例，說明基于圖像的準(zhǔn)確計數(shù)器對于評估樣品制備的數(shù)量和質(zhì)量至關(guān)重要。收獲后，AsPC-1細胞發(fā)生不完全解離。生成的圖像清楚地顯示，很大一部分細胞內(nèi)容物仍被納入結(jié)合的簇中，高達9%，而AsPC-1的活力僅為56%。根據(jù)活力和細胞分離情況，該樣品不適合下游處理。在許多情況下，單細胞的樣品細胞是有限的，需要低細胞濃度和重復(fù)計數(shù)才能獲得最佳和快速的細胞計數(shù)。在低細胞濃度的精確計數(shù)中，我們使用LUNA 1通道載玻片，它可以容納更大的細胞體積，即使細胞濃度低至1.00E+04個細胞/ml也可以進行計數(shù)。
用于單細胞測序的細胞樣品制備不充分的示例。“失敗的“AsPC-1細胞制備顯示死細胞含量高且含有不完全解離的細胞簇。LUNA-FX7的簇直方圖功能可以準(zhǔn)確評估細胞簇百分比與分離細胞的百分比。
分析完整的細胞核
對于一些單細胞測序應(yīng)用，分離的細胞需要進一步處理以產(chǎn)生分離且完整的細胞核。接下來我們評估了LUNA-FX7的實用性，以評估完全分離的細胞核的整體質(zhì)量和數(shù)量。為此，我們使用了3種細胞系-HL60、HeLa細胞和HEK細胞。下圖顯示了包含完整健康HL60細胞（左）、細胞核部分分離的HL60細胞（中）和細胞核完全分離（右）的3幅圖像，并且具有完整細胞膜的活細胞通過AO染色后呈現(xiàn)綠色熒光。相比之下，死細胞和分離的細胞核都因通過缺損或缺失的細胞膜吸收PI而呈現(xiàn)紅色熒光。然而，LUNA-FX7允許您使用大小信息區(qū)分完整的死細胞和完整的細胞核。例如，完整活體的HL-60的平均細胞大小為13.4微米，完全分離的細胞核的平均大小為8.3微米，表明細胞膜和血漿部分被成功去除。未完全分離的核尺寸經(jīng)測量平均為10.2 μm，表明分離核的質(zhì)量不足以進行下游處理。
HL 60細胞的細胞核分離過程的可能結(jié)果。明場(BF)圖像和帶標(biāo)簽的疊加熒光圖像可讓您輕松區(qū)分不同的細胞“狀態(tài)”。在BF圖像中，完整的細胞明顯比分離的細胞核更突出、更暗。同時，熒光圖像和計數(shù)可以實現(xiàn)準(zhǔn)確的定量評估。
此外，LUNA-FX7的高分辨率明場圖像可用于目視驗證分離核的質(zhì)量。例如，分離的細胞核可以很容易地與完整細胞區(qū)分開來，因為細胞核的邊界更薄，并且由于缺乏細胞膜而不明顯。
區(qū)分活核、死核和完整核。由于死細胞和完整的細胞核都缺乏完整的細胞膜，因此從碘化丙啶染色中可以看到紅色熒光。LUNA-FX7生成的BF圖像和尺寸測量可以常規(guī)地區(qū)分死細胞和完整的分離細胞核。
總之，LUNA-FX7在三通道成像（BF、GF和RF）方面的功能和靈敏度，以及復(fù)雜的標(biāo)記算法，使您可以在進行昂貴的下游處理之前建立樣品通過與否的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
評估分離的核和可能的結(jié)果。明場(BF)圖像和疊加熒光圖像可讓您輕松區(qū)分不同的細胞“狀態(tài)”。在BF 圖像中，完整的細胞比孤立的細胞核顯得明顯更突出、邊界更暗。同時，熒光圖像和計數(shù)可以實現(xiàn)準(zhǔn)確的定量評估�；畹耐暾毎眠灌こ�(GF)染色，分離的細胞核被染成紅色。LUNA-FX7可以準(zhǔn)確區(qū)分細胞質(zhì)大、細胞核小(HeLa)的樣品以及細胞核相對于細胞質(zhì)較大的細胞類型(HEK293)。
結(jié)論
對于單細胞測序，LUNA-FX7為探索提高細胞樣本準(zhǔn)確性和可靠性的研究人員提供了見解，以評估各種樣本類型中的細胞和分離的細胞核樣本的數(shù)量和質(zhì)量。
點成生物細胞計數(shù)解決方案
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標(biāo)簽：
細胞計數(shù)儀
單細胞測序
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