B10通過激活PD-1促進骨髓來源巨噬細胞（BMDM）的極化和促解炎功能

B10 Promotes Polarization and Pro-Resolving Functions of Bone Marrow Derived Macrophages (BMDM) Through PD-1 Activation

Keywords: B10 cells; PD-1; SPMs; macrophage; regulatory B cell.

調節(jié)性B細胞（B regs ）通過免疫調節(jié)細胞因子抑制過度炎癥。值得注意的是，分泌白介素-10（IL-10）的調節(jié)性B細胞稱為B10細胞（B-10），通過IL-10的生成在調節(jié)免疫反應中發(fā)揮關鍵作用。研究已表明，B-10抑制CD8+ T細胞增殖，B-10效應細胞的功能可通過MHC classII和CD40與CD4+ T細胞同源相互作用增強。

巨噬細胞也是調節(jié)炎癥狀態(tài)的主要角色。一般來說，促炎巨噬細胞（M1表型）有促炎介質的產生，抵抗微生物病原體并激活適應性免疫反應。相比之下，促解炎巨噬細胞（M2表型）極化以防止宿主過度炎癥反應并促進組織修復過程。巨噬細胞還通過中性粒細胞凋亡中的吞噬作用和特異性促解炎介質（SPMs）的分泌對炎癥的緩解做出關鍵貢獻。

為了闡明B-10與巨噬細胞之間的相互作用，研究已探討了兩種細胞類型之間潛在的配體-受體聯(lián)系。有趣的是，人類CD19+ CD24+ CD38+ B細胞（B regs 的一個子集）表現(xiàn)出程序性細胞死亡配體1（PD-L1）的表達升高。另一方面，觀察到表達程序性細胞死亡受體1（PD-1）的巨噬細胞表現(xiàn)出M2功能。PD-L1/PD-1軸是參與負向免疫調控的關鍵配體-受體信號通路。因此，表達PD-L1的B-10和表達PD-1的巨噬細胞之間的串擾可能通過PD-L1/PD-1的結合促進其炎癥消退功能。

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基于此，美國諾瓦東南大學牙科學院口腔科學與轉化研究系團隊探討了B-10是否能通過PD-L1/PD-1連接增強巨噬細胞促解炎功能。研究表明，B-10增強了M2型巨噬細胞極化，上調了PD-1表達，并促進了吞噬細胞活性和特異性SPMs產生等促解炎功能。這種對巨噬細胞促解炎功能的誘導需要細胞間的接觸，尤其是通過PD-1激活。研究成果發(fā)表于 CELLS 期刊題為“B10 Promotes Polarization and Pro-Resolving Functions of Bone Marrow Derived Macrophages (BMDM) Through PD-1 Activation”。

首先，研究了B-10細胞通過直接細胞間相互作用影響巨噬細胞極化的能力。對BMDMs與B-10進行共培養(yǎng)，建立四個實驗組：單獨M0巨噬細胞（M0）、初始B細胞與巨噬細胞（M0 + B）、間接共培養(yǎng)的B-10細胞與巨噬細胞（Tr M0 + B-10）、直接共培養(yǎng)的B-10細胞與巨噬細胞（M0 + B-10）。共培養(yǎng)48小時后，流式細胞術評估了各組M1巨噬細胞（F4/80+/CD86+）和M2巨噬細胞（F4/80+/CD206+/CD163+）的比例，發(fā)現(xiàn) F4/80+ CD86+ 細胞的比例在所有條件下無顯著變化。相比之下，與M0組相比，M0 + B-10組中F4/80+ CD206+ CD163+ 細胞的比例和出現(xiàn)頻率均顯著升高，其他兩組未檢測到顯著變化。這些結果表明，B-10細胞通過細胞間直接接觸增強M2巨噬細胞的極化，而不影響M1巨噬細胞的分化。

隨后，評估了B-10細胞與BMDMs共培養(yǎng)是否能增強PD-1表達。與單獨M0組相比，M0+B組的PD-1蛋白或mRNA水平未見顯著變化，然而，M0 + B-10組的PD-1表面蛋白和 Pdcd1 mRNA表達顯著增加，Tr M0 + B-10 組PD-1蛋白水平未顯著增加，但Pdcd1基因表達明顯下降。這些結果表明，巨噬細胞中B-10細胞對PD-1的上調需要直接的細胞間接觸。

M2巨噬細胞可進一步細分為四個亞群：M2a、M2b、M2c和M2d。如前所述，B-10細胞通過細胞間直接接觸促進M2巨噬細胞極化。為探究共培養(yǎng)巨噬細胞中哪些M2亞群相關的細胞因子上調，評估了Il10及多種M2亞群標志物的mRNA表達水平，包括M2a相關標記物Il1rn和Arg1，M2b相關標記物Il1β、Il6、Ccl1，M2c相關標志物Tgfβ，以及M2d相關標記物Vegfα。與M0組相比，M0+B組細胞因子表達無顯著差異，Tr M0 + B10組Arg1 mRNA表達顯著升高（圖1 C），M0 + B-10組在Il10、Il1rn、Arg1、Il6和Ccl1的mRNA水平上顯著升高（圖1 A-C、E、F）。 此外，在比較Tr M0 + B-10和M0 + B-10組時，后者中M2a相關基因和M2b相關基因水平顯著升高（圖1 A-C、E、F）。這些結果表明，直接細胞間接觸是B-10細胞調控M2a和M2b巨噬細胞因子表達的關鍵機制。

圖1     B-10細胞增強巨噬細胞中的M2相關細胞因子。

吞噬活性是巨噬細胞活性的一個關鍵促解炎方面，因此，接下來評估了B-10細胞是否增強了這一功能。流式細胞術數(shù)據顯示，M0 + B組吞噬細胞比例無變化，Tr M0 + B-10組的吞噬活性顯著增強，而M0 + B-10組表現(xiàn)出顯著更高的吞噬活性。免疫熒光染色結果顯示，Tr M0 + B-10組和M0 + B-10組的pHrodo™ 生物顆粒陽性細胞顯著增加，且后者觀察到更多的陽性細胞。這些結果表明，B-10細胞主要通過直接相互作用增強巨噬細胞吞噬功能。

被B-10細胞極化的巨噬細胞通過直接細胞間接觸表現(xiàn)出PD-1表達增加和向M2表型轉變的趨勢。然而，該過程中具體的配體-受體相互作用仍不明確。因此，實驗研究了B-10細胞是否通過巨噬細胞上的PD-1和B-10細胞上的PD-L1調節(jié)促解炎巨噬細胞的極化。PD-1在PD-1 KO BMDMs 中被降低（圖2 A、B），Pg.-LPS和CpG刺激可增強B-10細胞上的PD-L1表達（圖2 C、D）。共培養(yǎng)48小時后，流式細胞術評估以下各組的M1和M2表型標志物：WT M0、WT M0 + B、WT M0 + B10、PD-1 KO M0、PD-1 KO M0 + B，以及PD-1 KO M0 + B10。數(shù)據顯示，與單獨PD-1 KO M0相比，WT M0 + B組或WT M0 + B10組F4/80+ CD86+ 細胞的比例沒有一致的增加，PD-1 KO M0 + B組或 PD-1 KO M0 + B10 組也沒有一致的增加（圖2 E、F）。雖然F4/80+、CD206+和CD163+ 三陽性細胞數(shù)量在WT M0 + B中與WT M0無顯著差異，但在WT M0 + B10組中顯著增加（圖2 G、H）。然而，與單獨PD-1 KO M0組相比，PD-1 KO M0 + B組或PD-1 KO M0 + B10組無統(tǒng)計學差異（圖2 G、H）。這表明，B-10細胞與巨噬細胞之間的PD-L1/PD-1軸對于誘導M2型巨噬細胞極化至關重要。

接著，檢測了PD-L1/PD-1連接在調控M2相關細胞因子表達中的作用。野生型（WT）巨噬細胞與初始B細胞共孵育，細胞因子mRNA水平與WT M0對照組無顯著變化。相比之下，與B-10培養(yǎng)的WT BMDM 組M2a和M2b的基因表達顯著升高。相反，使用初始B細胞培養(yǎng)的PD-1 KO巨噬細胞相比PD-1 KO M0對照組，CCL1 mRNA水平顯著下降。在與B-10細胞培養(yǎng)的PD-1 KO巨噬細胞中，Tgfβ和Vegfα的mRNA水平顯著降低，而Il10、Il6和Ccl1 mRNA水平顯著升高。這說明，B-10細胞與巨噬細胞之間的PD-L1/PD-1相互作用主要增強了M2a相關細胞因子的產生，而M2b相關細胞因子表達似乎不受PD-L1/PD-1信號傳導的影響。

圖2   B-10細胞通過PD-L1/PD-1連接誘導巨噬細胞從M0 到M2極化。

進一步地，通過在共培養(yǎng)實驗中使用PD-1 KO巨噬細胞，實驗探討了PD-L1/PD-1信號對巨噬細胞中B-10誘導吞噬作用的影響。與B-10細胞共培養(yǎng)的WT巨噬細胞中，吞噬巨噬細胞的比例顯著增加，但在 WT BMDMs和初始B淋巴細胞共培養(yǎng)條件下則無顯著增加。相比之下，將PD-1 KO BMDM與初始B淋巴細胞或B-10共培養(yǎng)，吞噬細胞的比例降低。這些數(shù)據表明，B-10主要通過PD-L1/PD-1連接促進巨噬細胞吞噬能力。

最后，為評估B-10細胞是否通過PD-L1/PD-1信號驅動SPMs合成，利用液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）分析了脂質組學。主成分分析（PCA）以二維（圖3 A）和三維（圖3 B）格式呈現(xiàn)，揭示了兩個集群之間不同的SPM特征。一個簇包括WT M0、WT M0 + B、PD-1 KO M0和PD-1 KO M0 + B，另一個則包括WT M0 + B10和PD-1 KO M0 + B10，B-10共培養(yǎng)條件與其他組明顯區(qū)分開（圖3 A、B）。熱圖分析顯示，有四個SPMs——18-羧基二醇LXB4、AT-RvD4、15-腎上腺素LXA4和RvD2——在共培養(yǎng)過程中B-10存在時明顯高于其他組（圖3 C）�；鹕綀D分析發(fā)現(xiàn)，RvD2（圖3 E、H）和15-epi LXA4（圖3 E、I）在WT M0 + B-10中顯著上調（圖3 D-G）。值得注意的是，這些升高的SPMs（RvD2和15-epi LXA4）在PD-1 KO M0 + B組和PD-1 KO M0 + B10組中缺失（圖3 F、G）。

此外，由于SPM通路涉及15-脂氧酶（15-LOX），因此研究了Alox15基因表達。與單獨WT M0相比，WT M0 + B中 Alox15 mRNA水平未顯著變化，但在 WT M0 + B-10中顯著增加，PD-1 KO M0、PD-1 KO M0 + B 和 PD-1 KO M0 + B10 組之間未檢測到差異（圖3 J）。這些發(fā)現(xiàn)表明，B-10細胞主要通過PD-L1/PD-1信號促進RvD2和15-epi LXA4的合成，以及Alox15基因表達。

圖3     B-10細胞通過PD-L1/PD-1相互作用刺激專門的促解炎介質（SPM）合成。

總之，該研究表明，小鼠原級骨髓來源巨噬細胞中PD-L1/PD-1的結合增加了PD-1+ M2巨噬細胞的數(shù)量，并增強了其吞噬活性和特定SPMs（RvD2和15-epi LXA4）的產生�；�于這些觀察，產生IL-10并表達PD-L1的B-10細胞有望作為一種新型免疫調節(jié)療法。特別是，B-10細胞促進與炎癥緩解相關的巨噬細胞功能的能力，可能有助于開發(fā)靶向療法。

參考文獻：Memida T, Cao G, Dalir Abdolahinia E, Ruiz S, Huang S, Hassantash S, Shindo S, Okamoto M, Yamashita S, Nakamura S, Suzuki M, Kawai T, Han X. B10 Promotes Polarization and Pro-Resolving Functions of Bone Marrow Derived Macrophages (BMDM) Through PD-1 Activation. Cells. 2025 Jun 7;14(12):860. doi: 10.3390/cells14120860. PMID: 40558486; PMCID: PMC12191351.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40558486/

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