巨噬細(xì)胞機(jī)械免疫調(diào)節(jié)血管生成和成骨作用影響骨折愈合的再生環(huán)境

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜且高度協(xié)調(diào)的過程，包含連續(xù)且緊密相關(guān)的炎癥、修復(fù)和重塑階段。愈合級(jí)聯(lián)從炎癥階段開始，特征是形成止血并作為細(xì)胞臨時(shí)支架的纖維蛋白凝血塊，隨后是炎癥性免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和募集，其中巨噬細(xì)胞（Mφs）已知在免疫反應(yīng)中發(fā)揮長(zhǎng)期作用。當(dāng) Mφs 進(jìn)入受損組織時(shí)，會(huì)遇到高度炎癥信號(hào)，誘導(dǎo)其進(jìn)入主要的“促炎”M1樣表型，驅(qū)動(dòng)促炎細(xì)胞因子的釋放（包括IL-6、IL-8、TNF-α），這些細(xì)胞因子同時(shí)在骨折愈合過程中協(xié)調(diào)下游再生過程。持續(xù)的炎癥會(huì)導(dǎo)致愈合受損或延遲，因此，成功度過炎癥階段高度依賴于從M1樣表型向“抗炎”M2樣表型的嚴(yán)格調(diào)控轉(zhuǎn)換。這一 M2 轉(zhuǎn)換與修復(fù)期的進(jìn)展相吻合，Mφs 分泌如抗炎細(xì)胞因子 IL-10 等因子，在成骨/軟骨生成譜系的后續(xù)調(diào)控中起關(guān)鍵作用。由于 Mφs 在骨折愈合的所有階段都具有關(guān)鍵的時(shí)間作用，因此，在早期纖維蛋白血腫中實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)是促進(jìn)再生的有希望的新途徑。

骨骼修復(fù)的一個(gè)強(qiáng)有力調(diào)節(jié)因子是機(jī)械負(fù)荷（骨碎片間應(yīng)變），它可能作用于早期骨折血腫來調(diào)節(jié)免疫環(huán)境。重要的是，數(shù)據(jù)表明早期機(jī)械線索對(duì)長(zhǎng)期愈合反應(yīng)起關(guān)鍵作用，因?yàn)楣钦酆蟮谝恢苁┘拥膽?yīng)變大小與長(zhǎng)期骨再生呈顯著正相關(guān)。這表明早期血腫的機(jī)械環(huán)境是通過潛在地影響免疫反應(yīng)來調(diào)節(jié)愈合的關(guān)鍵因素。事實(shí)上，免疫反應(yīng)受組織微環(huán)境信號(hào)控制，例如在許多疾病狀況、炎癥狀態(tài)以及衰老背景下觀察到的生物物理性質(zhì)變化。然而，目前尚不清楚機(jī)械介導(dǎo)的 Mφ 表型變化是否通過間接影響早期血管形成和后期骨骼修復(fù)來影響再生環(huán)境。

點(diǎn)擊了解：仿生壓力細(xì)胞培養(yǎng)儀

機(jī)械力學(xué)-免疫學(xué)領(lǐng)域的研究正在興起，旨在探討機(jī)械線索如何塑造免疫細(xì)胞表型和功能。最近，來自愛爾蘭圣三一大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心及先進(jìn)材料與生物工程研究中心（AMBER）的團(tuán)隊(duì)首次設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了一種復(fù)制早期骨折血腫部位動(dòng)態(tài)負(fù)荷條件的專用 3D 體外平臺(tái)，通過表征 Mφ 表型、分泌組及可溶性因子對(duì)血管形成和成骨的影響來評(píng)估巨噬細(xì)胞對(duì)不同水平壓縮應(yīng)變的反應(yīng)，并研究了如何利用局部力學(xué)來調(diào)節(jié)高度炎癥環(huán)境以促進(jìn)更有利于長(zhǎng)期愈合的再生環(huán)境。研究成果發(fā)表于 Acta Biomaterialia 期刊題為“Mechano-immunomodulation of macrophages influences the regenerative environment of fracture healing through the regulation of angiogenesis and osteogenesis”。

首先，通過在不同染色強(qiáng)度的循環(huán)壓縮刺激下，對(duì)已建立的 M1/M2 樣及再生巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記進(jìn)行基因和蛋白質(zhì)表達(dá)分析，解析巨噬細(xì)胞表型調(diào)控。綜合來看，結(jié)果支持人類巨噬細(xì)胞具有機(jī)械反應(yīng)性，對(duì)負(fù)荷強(qiáng)度敏感，反應(yīng)在表型和分泌組的變化。值得注意的是，最低幅度 5% 的應(yīng)變代表了固定良好的骨缺損，通常在臨床上表現(xiàn)出更好的愈合效果，能夠促進(jìn)再生細(xì)胞因子 IL-10 的產(chǎn)生，同時(shí)抑制促炎 IL-6 因子的分泌。較高的35% 應(yīng)變代表未修復(fù)缺陷和愈合不良，導(dǎo)致分泌組再生能力較低，VEGF-A 和 IL-10 水平下降。

缺損部位血管的浸潤(rùn)發(fā)生在骨沉積之前，是骨愈合成功的關(guān)鍵。重要的是，巨噬細(xì)胞已知是血管形成的調(diào)節(jié)者，而血管形成高度依賴于其表型。因此，隨后確認(rèn)了在巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基（CM）存在下差異極化巨噬細(xì)胞對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）形成管狀結(jié)構(gòu)能力的基線效應(yīng)（圖1 B）。雖然與陰性對(duì)照組相比，M0 樣巨噬細(xì)胞 CM 未改變血管形成結(jié)果，但 M1 樣巨噬細(xì)胞 CM 導(dǎo)致連接、節(jié)點(diǎn)和分支的形成增加，M2a 樣 CM 進(jìn)一步增強(qiáng)。這些結(jié)果與巨噬細(xì)胞中分別通過啟動(dòng)血管形成和促進(jìn)血管成熟的 M1 樣和 M2 樣表型的血管生成作用相符。

此外，研究了負(fù)荷巨噬細(xì)胞分泌組在決定管形成中的影響。高幅度 20–35% 機(jī)械負(fù)荷巨噬細(xì)胞 CM 時(shí)，HUVECs 重組明顯減少（圖1 A）。這一趨勢(shì)經(jīng)定量驗(yàn)證，與靜態(tài)對(duì)照相比，暴露于低 5% 應(yīng)變的巨噬細(xì)胞未改變形成的連接、節(jié)點(diǎn)或分支數(shù)量，但暴露于高 20% 應(yīng)變導(dǎo)致連接、節(jié)點(diǎn)和分支數(shù)量的顯著抑制，最高 35% 應(yīng)變也出現(xiàn)類似趨勢(shì)（圖1 B）。這些數(shù)據(jù)表明，機(jī)械激活的巨噬細(xì)胞分泌旁分泌因子，以強(qiáng)度依賴性方式對(duì)血管生成產(chǎn)生負(fù)面影響，更高的壓縮負(fù)荷會(huì)誘發(fā)抑制性血管生成巨噬細(xì)胞分泌組，從而可能延遲或損害骨骼早期愈合階段。

圖1     機(jī)械激活的巨噬細(xì)胞分泌旁分泌因子，以強(qiáng)度依賴性的方式對(duì)血管生成產(chǎn)生負(fù)面影響。

接下來，探討了巨噬細(xì)胞分泌的旁分泌因子在不同壓縮強(qiáng)度下是否以及如何改變?nèi)斯撬鑱碓撮g充質(zhì)干細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞（MSCs）的成骨分化。有趣的是，與靜態(tài)對(duì)照相比，雖然較低的負(fù)荷（5%、20%）似乎對(duì) RUNX2 成骨標(biāo)志物的 mRNA 水平?jīng)]有影響（圖2 A），但較高的 35% 負(fù)荷則使其顯著增加1.62倍，與 M2a 表型相當(dāng)。此外，由于機(jī)械壓縮后 SOX9 軟骨生成標(biāo)志物表達(dá)未發(fā)生變化，導(dǎo)致 RUNX2/SOX9 比值以幅度依賴的方式增強(qiáng)，與靜態(tài)對(duì)照相比，35% 負(fù)荷巨噬細(xì)胞分泌組的 RUNX2/SOX9 比率顯著增加1.63倍，這符合 M2a 極化后的趨勢(shì)，表明成骨潛力增強(qiáng)。在檢測(cè) BMP-2 mRNA 水平時(shí)，這一點(diǎn)得到了進(jìn)一步的支持（圖2 A），其中 BMP-2 的表達(dá)以幅度依賴的方式顯著降低。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證和補(bǔ)充上述發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行了 14 天礦化試驗(yàn)評(píng)估了負(fù)荷巨噬細(xì)胞分泌組對(duì) hMSCs 長(zhǎng)期成骨作用的影響。首先觀察到 hMSC 增殖和 ALP 活性均無顯著變化，但有趣的是，巨噬細(xì)胞無論表型如何，在14天后都會(huì)分泌顯著抑制 hMSC 礦化的因子。此外，機(jī)械刺激 M0 巨噬細(xì)胞導(dǎo)致旁分泌因子的分泌，進(jìn)一步抑制長(zhǎng)期成骨，在較高的 20–35% 負(fù)荷下達(dá)到顯著水平，與靜態(tài)對(duì)照組相比鈣沉積分別降低 81% 和 84%（圖2 B–C）。這一下降趨勢(shì)與 M1 樣礦化結(jié)果相符，而 M1 型已已知對(duì)長(zhǎng)期骨沉積有害。

這些發(fā)現(xiàn)共同指向MSCs中早期骨生成信號(hào)的強(qiáng)力調(diào)控，最終通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分泌組抑制后期骨沉積，尤其是在高強(qiáng)度壓縮應(yīng)變后。

圖2    機(jī)械激活的巨噬細(xì)胞分泌旁分泌因子，以強(qiáng)度依賴性的方式介導(dǎo)成骨。

既然機(jī)械刺激可以以幅度依賴的方式調(diào)節(jié) M0 樣巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)，進(jìn)一步關(guān)注的是是否可以利用局部力學(xué)來抑制代表受損骨缺損的高度炎癥免疫環(huán)境（圖3 A）�；�于上述在未活化巨噬細(xì)胞中建立再生混合表型/分泌組的研究，以下實(shí)驗(yàn)選擇了中等幅度的 5% 壓縮應(yīng)變。通過研究編碼 M1 和 M2 樣表型的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在 5% 壓縮應(yīng)變下 M1 樣基因 CD80、CXCL9、CXCL10 和 CCR7 表達(dá)增強(qiáng)（圖3 B），同時(shí) MRC1 M2 標(biāo)志物也增加（圖3 C）但不顯著。值得注意的是，IL-10 mRNA 表達(dá)水平未因負(fù)荷而改變。這表明，將 M1 極化巨噬細(xì)胞暴露于適度的 5% 預(yù)負(fù)荷下，誘導(dǎo)其向 M1/ M2 樣表型的混合轉(zhuǎn)變，盡管偏向于促炎表型，這與之前的 M0 研究中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致，即較低負(fù)荷激活了 M0 樣巨噬細(xì)胞的混合表型。在蛋白質(zhì)水平上，機(jī)械刺激下 CD80 M1 和 CD206 M2 樣細(xì)胞表面標(biāo)記均上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)（圖3 D-E）。

隨后，試圖考察所得的混合表型是否與 M1 極化巨噬細(xì)胞高度炎癥分泌組的調(diào)控對(duì)應(yīng)。有趣的是，盡管炎癥基因有所增加，但中等 5% 的預(yù)負(fù)荷水平相比靜態(tài)對(duì)照組減少了炎癥細(xì)胞因子的分泌，如促炎 IL-6 因子、TNF-α 因子顯著下降（圖3 F），這符合再生性 M2a 表型的趨勢(shì)。值得注意的是，與靜態(tài)對(duì)照相比，機(jī)械刺激下 IL-8 的產(chǎn)生沒有變化。而且這種促炎水平的調(diào)節(jié)并未以 IL-10 和 VEGF-A 促再生細(xì)胞因子的分泌為代價(jià)。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了中度壓縮負(fù)荷在調(diào)節(jié)過度激活炎癥免疫反應(yīng)方面的潛力，這通常發(fā)生在受損的骨缺損中。

圖3    中度壓縮應(yīng)變可以改變高度炎癥性巨噬細(xì)胞的表型，從而抑制促炎巨噬細(xì)胞分泌組。

為了進(jìn)一步探討局部力學(xué)在受損環(huán)境中指導(dǎo)骨愈合過程的作用，通過前述的管形成試驗(yàn)評(píng)估了機(jī)械激活的 M1 極化巨噬細(xì)胞分泌組的血管生成再生特性。結(jié)果表明，在炎癥環(huán)境中，控制局部力學(xué)可以通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分泌組重塑血管化，承受適度負(fù)荷，血管的再生能力增強(qiáng)。這些發(fā)現(xiàn)為局部力學(xué)通過調(diào)節(jié)局部免疫環(huán)境間接重塑早期血管形成提供了證據(jù)。

最后，通過前述的成骨試驗(yàn)評(píng)估機(jī)械激活的 M1 極化巨噬細(xì)胞分泌組的成骨再生特性。暴露于機(jī)械刺激 M1 巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基的人 MSCs 顯示出 RUNX2 適度但不顯著的增加（圖4 A），同時(shí)未影響軟骨生成 SOX9 水平，因此與靜態(tài) CM 對(duì)照相比，RUNX2/SOX9 比率呈上升趨勢(shì)，盡管不顯著。這些結(jié)果表明，hMSCs 早期成骨譜系承諾可能向 M2a 樣表型轉(zhuǎn)變（圖4 A），進(jìn)一步體現(xiàn)在負(fù)荷 M1 CM 處理后 BMP-2 mRNA 水平的顯著下降。

為了研究骨形成的長(zhǎng)期影響，進(jìn)行了前述的14天礦化分析，觀察到 hMSCs 的增殖和 ALP 蛋白生成均未顯著變化。此外，雖然 5% 預(yù)負(fù)荷巨噬細(xì)胞分泌組能夠推動(dòng)骨生成基因表達(dá)的微小變化，但這并未轉(zhuǎn)化為后續(xù)礦化結(jié)果，這一點(diǎn)從與靜態(tài)對(duì)照 CM 相比鈣沉積變化不顯著所證明（圖4 B）。這些結(jié)果表明，適度負(fù)荷優(yōu)先調(diào)控修復(fù)早期階段，通過靶向巨噬細(xì)胞表型和早期血管形成，而在受損環(huán)境中對(duì)后期成骨作用影響有限。

圖4     較低的動(dòng)態(tài)壓縮負(fù)荷對(duì)通過調(diào)節(jié)高度炎癥性巨噬細(xì)胞分泌組對(duì)骨沉積的后續(xù)協(xié)調(diào)影響有限。

圖5    圖形概要

利用該模型，該研究證明，巨噬細(xì)胞對(duì)壓縮負(fù)荷強(qiáng)度具有響應(yīng)性且敏感性，中等負(fù)荷（5%應(yīng)變）會(huì)產(chǎn)生再生巨噬細(xì)胞混合表型和分泌組，而高度負(fù)荷（35%應(yīng)變）則產(chǎn)生對(duì)血管生成和骨生成不利的分泌組。此外，中等幅度應(yīng)變還可以抑制炎癥性受損骨折模型中的炎癥�？傊�，該研究提供了有力證據(jù)，表明局部機(jī)械線索對(duì)巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，這有助于理解局部固定器剛度對(duì)骨折修復(fù)的影響，并最終證明了一種調(diào)節(jié)骨缺損早期免疫反應(yīng)的新方法。

參考文獻(xiàn)：Petrousek SR, Kronemberger GS, O'Brien G, Hughes C, O'Rourke SA, Lally C, Dunne A, Kelly DJ, Hoey DA. Mechano-immunomodulation of macrophages influences the regenerative environment of fracture healing through the regulation of angiogenesis and osteogenesis. Acta Biomater. 2025 Jun 15;200:187-201. doi: 10.1016/j.actbio.2025.05.045. Epub 2025 May 21. PMID: 40409508.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40409508/

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