急性剪切力在靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人大隱靜脈誘導(dǎo)TWIST介導(dǎo)內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

Acute Shear Stress Induces TWIST-Mediated EndMT in Venous Endothelial Cells and Human Long Saphenous Veins

Keywords: CABG; Dexamethasone; EndMT; saphenous vein.

冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（CABG）是治療嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈疾病的有效方法，其中長(zhǎng)隱靜脈/大隱靜脈（LSV）是最常用的導(dǎo)管。然而，LSV移植物的長(zhǎng)期通暢率受到內(nèi)膜增生（IH）發(fā)展的限制，這會(huì)導(dǎo)致移植物失敗和不良心血管事件。IH是一個(gè)多因素影響的過(guò)程，當(dāng)靜脈植入動(dòng)脈循環(huán)時(shí)，LSVs暴露于急性血流動(dòng)力學(xué)可能在這一過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）與靜脈移植物插入動(dòng)脈循環(huán)后重塑過(guò)程中的細(xì)胞表型適應(yīng)調(diào)節(jié)有關(guān)，TGFβ/SMAD信號(hào)通路在這一過(guò)程中起著重要作用。研究已證明，靜脈（而非動(dòng)脈）內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）急性暴露于動(dòng)脈剪切應(yīng)力與不同促炎通路的激活（包括MAPK和NF-kB）有關(guān)，從而導(dǎo)致不同促炎分子（如VCAM和MCP-1）的上調(diào)。此外，動(dòng)脈剪切而不是靜脈剪切激活了靜脈ECs中的這種反應(yīng)。

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糖皮質(zhì)激素可調(diào)節(jié)多種重要的心血管、代謝和免疫功能。zhong所周知，糖皮質(zhì)激素可以顯著抑制TGFβ的產(chǎn)生，并調(diào)節(jié)SMAD家族和EndMT各種成員的活性。已有研究評(píng)估了合成糖皮質(zhì)激素（人造），如地塞米松（Dexamethasone），在調(diào)節(jié)血管炎癥和靜脈移植物IH中的作用。

基于此，英國(guó)萊斯特大學(xué)心血管科學(xué)系團(tuán)隊(duì)在最近的一項(xiàng)研究中旨在深入了解急性動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)對(duì)體外 HUVECs 和離體 LSVs 中 EndMT 激活的影響，并探討地塞米松（Dex）在 LSVs 中調(diào)節(jié) EndMT 的作用。研究成果發(fā)表于 CELLS 期刊題為“Acute Shear Stress Induces TWIST-Mediated EndMT in Venous Endothelial Cells and Human Long Saphenous Veins”。

首先，研究了急性層流動(dòng)脈剪切應(yīng)力（LSS，0.5 或 12 dyn/cm2分別模擬靜脈和動(dòng)脈剪切應(yīng)力）對(duì)體外 EndMT 激活的影響。結(jié)果觀察到，使用平行板流動(dòng)室將LSS應(yīng)用于HUVECs 4小時(shí)激活炎癥介質(zhì)，如MCP-1和CXCL8的表達(dá)增加，還注意到血管內(nèi)皮鈣粘蛋白（VE-CADHERIN）的顯著下調(diào)和波形蛋白（VIMENTIN）、TWIST1和TWIST2基因表達(dá)的上調(diào)（圖1 A）。這些數(shù)據(jù)表明，ASS 可以觸發(fā) HUVECs 中的 EndMT。

為了檢查T(mén)GFβ的作用，使用TGFβ的藥理學(xué)抑制劑（SB505124），該抑制劑已知可抑制激活素A受體II型樣激酶（ALK5）。結(jié)果觀察到，用抑制劑預(yù)處理HUVECs（5μmol / L，60分鐘）4小時(shí)后在轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)水平上均抑制了對(duì)上述表型變化的誘導(dǎo)。這種抑制與早期（45 分鐘）抑制 ALK5 激活和 SMAD 2/3 磷酸化有關(guān)。因此，可得出結(jié)論，HUVECs 對(duì) LSS 下 TGFβ 依賴(lài)性誘導(dǎo)的 EndMT 敏感。

此外，在剪切刺激的HUVECs中使用特異性siRNAs抑制信使RNA表達(dá)以評(píng)估TWIST轉(zhuǎn)錄因子TWIST1&2的作用。免疫染色（圖1 E）和WB檢測(cè)顯示，沉默 TWIST1 或 TWIST2 抑制 EndMT 會(huì)在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平上改變 LSS 下 HUVECs的變化，但不影響上游 ALK5 對(duì) SMAD 2/3 磷酸化的激活，表明TWIST1和TWIST2都可以在體外LSS刺激下的EndMT過(guò)程中發(fā)揮作用。盡管TWIST1和TWIST2沒(méi)有相互調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)，但正如在不同條件下所顯示的那樣，在急性動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)下，兩者都需要合作來(lái)激活反應(yīng)。

圖1     動(dòng)脈剪切應(yīng)力對(duì)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Ecs）中促炎基因和 EndMT 基因的影響。

接下來(lái)，使用10μmol/L的Dex預(yù)處理60分鐘，注意到HUVEC對(duì)LSS的反應(yīng)發(fā)生了顯著變化。Dex預(yù)處理導(dǎo)致在45分鐘時(shí)抑制ALK5激活和SMAD2/3磷酸化（圖2 A）。此外，它與 TWIST1、TWIST2 和 VIM 的抑制有關(guān)，同時(shí)免疫染色和 WB檢測(cè)顯示，其在轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)水平上恢復(fù)VE-鈣粘蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果表明，使用Dex可以通過(guò)靶向部分ALK5/SMAD/TWIST通路來(lái)抑制HUVECs中響應(yīng)LSS的EndMT變化。

圖2    地塞米松通過(guò)剪切應(yīng)力抑制培養(yǎng)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Ecs）中的EndMT激活。活。

進(jìn)一步地，研究人員通過(guò)暴露于離體急性動(dòng)脈流的新鮮采集的人隱靜脈來(lái)驗(yàn)證上述體外發(fā)現(xiàn)。對(duì)暴露于急性動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)4小時(shí)的靜脈段進(jìn)行了空間細(xì)胞RNA測(cè)序，鑒定出一組同時(shí)具有EC和SMC表型（EC/SMC）的細(xì)胞，表明它可能代表中間狀態(tài)的EndMT。該簇中鑒定出16954個(gè)基因，其中，486 個(gè)在流動(dòng)條件下受到顯著差異調(diào)節(jié)，包括 TWIST2 。當(dāng)特別關(guān)注該簇群中的 TWIST2 網(wǎng)絡(luò)分析時(shí)，注意到與 TGIF1、FOXC2、CD44、CYP1B1、NFIC、REL 和 FOXC1 等基因的關(guān)聯(lián)及其后續(xù)關(guān)聯(lián)。這些基因參與炎癥、EndMT、免疫信號(hào)傳導(dǎo)、分化和細(xì)胞凋亡等過(guò)程。

最后，為了驗(yàn)證上述與 EndMT 相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，建立了靶向方法，包括全組織的 RT-PCR 和 RNAscope，并研究了離體Dex 對(duì)靜脈進(jìn)行簡(jiǎn)短預(yù)處理的影響。除了抑制對(duì)急性動(dòng)脈血流的促炎反應(yīng)外，使用RT-PCR和RNAscope檢測(cè)顯示（圖3 A），Dex預(yù)處理在4小時(shí)時(shí)在轉(zhuǎn)錄水平上抑制TWIST1和TWIST2的表達(dá)，這證明了ECs中兩種RNA轉(zhuǎn)錄的激活和定位，這些轉(zhuǎn)錄被Dex處理抑制（圖3 B）。此外，這種簡(jiǎn)短的預(yù)處理能夠抑制 RNA 上VE-鈣粘蛋白和 VIM 在 ECs 中的 EndMT 表型變化，還顯著調(diào)節(jié)了TWIST1、TWIST2、VE-鈣粘蛋白和VIM蛋白水平。免疫組織染色顯示，Dex效果還與ALK5表達(dá)和SMAD 2/3激活（磷酸化）的快速（45分鐘）顯著降低有關(guān)（圖3 E）。有趣的是，當(dāng)使用 RNAscope 觀察 SNAIL1 轉(zhuǎn)錄時(shí)，注意到 ECs 中沒(méi)有激活，僅存在于 SMCs 中，這被 Dex 預(yù)處理抑制，表明 TWIST 和 SNAIL 轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型起作用。

同時(shí)，考慮到長(zhǎng)時(shí)間流動(dòng)刺激實(shí)驗(yàn)的局限性，還比較了短暫Dex預(yù)處理后LSV培養(yǎng)10 天后的效果，發(fā)現(xiàn)短暫的單次處理足以在培養(yǎng)后10天抑制EndMT。當(dāng)比較低流量對(duì)LSV ECs激活的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)低流量不會(huì)觸發(fā)離體LSVs的任何EndMT變化�？� SMAD 水平也沒(méi)有變化。因此，可得出結(jié)論，用Dex進(jìn)行短暫的預(yù)處理（60分鐘）可以通過(guò)抑制TGFβ / SMAD1通路來(lái)抑制LSV ECs中響應(yīng)剪切應(yīng)力的EndMT激活。

圖3    用地塞米松預(yù)處理人長(zhǎng)隱靜脈可抑制內(nèi)皮細(xì)胞（EC）中剪切應(yīng)力對(duì) EndMT 的激活。

圖4   圖形概要

綜上所述，該研究結(jié)果表明，TGFβ-/SMAD-/TWIST1&2 介導(dǎo)的 EndMT 在體外暴露于急性動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)時(shí)在靜脈移植物內(nèi)被激活，并且用地塞米松對(duì)靜脈進(jìn)行短暫預(yù)處理可以抑制其激活和相關(guān)的微鈣化，這可能會(huì)調(diào)節(jié)靜脈移植物內(nèi)膜增生的發(fā)展。盡管這項(xiàng)研究中重點(diǎn)關(guān)注ALK5/SMAD通路，但有證據(jù)表明糖皮質(zhì)激素可有效抑制BMP2等骨形態(tài)發(fā)生蛋白表達(dá)。因此，討論 LSVs 中的 EndMT 以及 BMP 在未來(lái)研究中的作用將會(huì)很有趣。最重要的是，這項(xiàng)研究側(cè)重于短期變化，未來(lái)將結(jié)合空間細(xì)胞測(cè)序和 RNASCope 等新技術(shù)在先前動(dòng)物研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行擴(kuò)展，以研究地塞米松短期局部預(yù)處理對(duì)大型動(dòng)物模型中 IH 形成的影響。

參考文獻(xiàn)：Ladak SS, McQueen LW, Tomkova K, Layton GR, Murphy GJ, Zakkar M. Acute Shear Stress Induces TWIST-Mediated EndMT in Venous Endothelial Cells and Human Long Saphenous Veins. Cells. 2025 Sep 2;14(17):1369. doi: 10.3390/cells14171369. PMID: 40940783; PMCID: PMC12428368.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40940783/

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