PacBio Kinnex單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)原理、流程及其應(yīng)用案例

在生命科學(xué)的微觀世界里，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)讓我們得以傾聽每一個(gè)細(xì)胞的“低語”。 然而，傳統(tǒng)的短讀長(zhǎng)測(cè)序就像“盲人摸象”， 通過零碎的片段推測(cè)整體，只能得到基因表達(dá)的輪廓，無法描繪出轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體千變?nèi)f化的全貌。而這些被忽略的異構(gòu)體信息，卻往往包含理解細(xì)胞類型、狀態(tài)和功能差異的關(guān)鍵�，F(xiàn)在，PacBio Kinnex 單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組解決方案帶來了革命性的突破，它使單細(xì)胞測(cè)序不再局限于“摸到象腿或象鼻”，以HiFi長(zhǎng)讀長(zhǎng)、高精度和高通量的優(yōu)勢(shì)，直接對(duì)單個(gè)細(xì)胞中全長(zhǎng)RNA分子進(jìn)行完整測(cè)序，涵蓋所有曾經(jīng)被短讀長(zhǎng)“錯(cuò)過”的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體細(xì)節(jié)，同時(shí)精準(zhǔn)捕獲細(xì)胞Barcode和UMI信息，使研究人員真正告別“盲人摸象”的時(shí)代，能夠站在單個(gè)細(xì)胞的維度看清哪些特定異構(gòu)體被表達(dá)，從而解讀出每個(gè)細(xì)胞內(nèi)部更豐富、更精確的“完整故事”，為癌癥腫瘤免疫和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域帶來前所未有的洞察。

01  Kinnex single-cell RNA產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

長(zhǎng)讀長(zhǎng)
長(zhǎng)讀長(zhǎng)可直接獲得從5'至3'端的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本信息，便于檢測(cè)到新基因和轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。

高準(zhǔn)確性
HiFi測(cè)序的準(zhǔn)確率可達(dá)99.9%（Q30），準(zhǔn)確檢測(cè)到細(xì)胞Barcode和UMI信息的同時(shí)能夠精確表征可變剪接位點(diǎn)、解析融合基因信息以及區(qū)分細(xì)胞亞型。

高通量
Kinnex單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組建庫方案使用16x cDNA串聯(lián)方式進(jìn)行文庫構(gòu)建，大幅提升了全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序通量，降低了建庫測(cè)序的成本。

02  Kinnex單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組技術(shù)原理與流程

Kinnex 單細(xì)胞全長(zhǎng)RNA試劑盒采用MAS-Seq方法來提高PacBio長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的通量。MAS-Seq 是一種將cDNA分子連接成較長(zhǎng)片段的串聯(lián)方法。對(duì)串聯(lián)分子測(cè)序產(chǎn)生的 HiFi reads 進(jìn)行生物信息學(xué)拆分，即可檢索到原始cDNA序列。Kinnex單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組建庫流程以單細(xì)胞cDNA作為起始樣本，支持從10x Chromium Single Cell 3' Kit（v3.1, v4）和Single Cell 5' Kit（v2, v3）生成的cDNA，作為Kinnex single-cell RNA試劑盒的輸入樣本，以16x cDNA串聯(lián)方式連接形成有序陣列，并在兩側(cè)添加接頭進(jìn)行文庫構(gòu)建，從而提高通量，減少測(cè)序成本，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)高效的單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。此外，Kinnex單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組建庫過程中也可加入文庫Barcode標(biāo)簽信息，支持多樣本混樣測(cè)序，增加了不同數(shù)據(jù)量實(shí)驗(yàn)需求的靈活性。
 
03  Kinnex single-cell RNA數(shù)據(jù)表現(xiàn)

上表為使用10x Chromium GEM-X Single Cell 5' 和 3' 試劑盒生成的PBMC cDNA通過Kinnex single-cell RNA試劑盒建成的單細(xì)胞文庫在PacBio的Revio和Vega長(zhǎng)讀長(zhǎng)平臺(tái)測(cè)序并使用SMRT Link中的Read Segmentation和Single-Cell Iso-Seq工作流程進(jìn)行分析后得到的測(cè)試數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，Kinnex數(shù)據(jù)具有高效的數(shù)據(jù)產(chǎn)出和良好的穩(wěn)定性。通常情況下，在Vega和Revio系統(tǒng)上的單張SMRT Cell產(chǎn)出的HiFi reads經(jīng)生信拆分還原后預(yù)計(jì)分別獲得50-60M和100-120M reads的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)產(chǎn)出。

左圖為進(jìn)一步使用三級(jí)生信工具CellTypist處理Revio測(cè)序得到的PBMC 10x 5' 單細(xì)胞SMRT Link輸出結(jié)果的細(xì)胞聚類UMAP圖，鑒定了PBMC數(shù)據(jù)集中含有的不同細(xì)胞類型。右圖為同時(shí)構(gòu)建HG002樣本的10x 5' 單細(xì)胞Kinnex和Illumina文庫后測(cè)序結(jié)果比對(duì)的Pearson相關(guān)性展示圖，Pearson相關(guān)性系數(shù)為0.992，由此可見兩者細(xì)胞UMI計(jì)數(shù)的高度一致性。

 
04  Kinnex single-cell RNA應(yīng)用案例解析

案例1

題目：Detection of isoforms and genomic alterations by high-throughput full-length single-cell RNA sequencing in ovarian cancer
研究領(lǐng)域：腫瘤學(xué)（卵巢癌）

主要結(jié)果：

圖1 研究設(shè)計(jì)概覽和長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體分析
 

圖2 細(xì)胞注釋聚類和細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體分布
 

圖3 腫瘤和患者特異性融合基因 IGF2BP2::TESPA1 檢測(cè)

 
了解癌癥的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性及其與腫瘤微環(huán)境（TME）的復(fù)雜相互作用需要單細(xì)胞分辨率的基因型和表型信息。在瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，研究者采用10x Genomics平臺(tái)進(jìn)行單細(xì)胞捕獲，結(jié)合串聯(lián)的實(shí)驗(yàn)策略對(duì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者的腫瘤和癌旁配對(duì)樣本進(jìn)行了基于PacBio全長(zhǎng)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共檢測(cè)到152,000個(gè)轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，其中超過52,000個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。該研究中，研究人員同時(shí)進(jìn)行了長(zhǎng)讀長(zhǎng)和短讀長(zhǎng)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)兩者單獨(dú)鑒定的細(xì)胞類型和種類占比都非常相似，并表明通過PacBio的全長(zhǎng)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可檢測(cè)到細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，揭示了腫瘤和間皮細(xì)胞中的差異異構(gòu)體表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)間皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)移中部分通過TGF-β/miR-29/膠原軸轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y相關(guān)成纖維細(xì)胞。此外，研究人員通過單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組準(zhǔn)確識(shí)別了融合基因，包括一種新的經(jīng)過scDNA測(cè)序驗(yàn)證的IGF2BP2::TESPA1融合，該融合在匹配的二代短讀長(zhǎng)測(cè)序中不僅沒有發(fā)現(xiàn)，且被錯(cuò)誤歸類為TESPA1基因高表達(dá)。這是由于二代測(cè)序讀長(zhǎng)較短，無法跨越和覆蓋基因的融合位點(diǎn)，僅捕獲到了該融合基因的 3' 端融合部分，即 TESPA1 基因部分，從而導(dǎo)致錯(cuò)誤的分析結(jié)果。

案例2

題目：Developmental isoform diversity in the human neocortex informs neuropsychiatric risk mechanisms
研究領(lǐng)域：神經(jīng)發(fā)育與疾病

主要結(jié)果：

圖1 妊娠中期發(fā)育中人類大腦新皮層的細(xì)胞類型特異性的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體多樣性的表征與細(xì)胞聚類和差異表達(dá)異構(gòu)體分析
 

圖2 以異構(gòu)體為中心的神經(jīng)遺傳風(fēng)險(xiǎn)機(jī)制解析，AKT3轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體受DNM影響的表征
 

PacBio Kinnex 單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組建庫流程需要使用Kinnex single-cell RNA kit (103-072-200)，前期單細(xì)胞cDNA樣本制備支持搭配10x Genomics的Chromium Single Cell 3' GEM Kit（v3.1, v4）和Single Cell 5' GEM Kit（v2, v3）使用。

近年來，隨著單細(xì)胞測(cè)序的深入研究，基于PacBio的單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已在各大頂刊中嶄露頭角，以其在可變剪接、基因融合和突變檢測(cè)的覆蓋范圍及測(cè)序準(zhǔn)確性方面的巨大優(yōu)勢(shì)，為精準(zhǔn)腫瘤學(xué)、癌癥疫苗藥物預(yù)測(cè)和神經(jīng)發(fā)育與疾病等領(lǐng)域的復(fù)雜生物學(xué)問題解析帶來了新的進(jìn)展，Kinnex方法帶來的高通量提升，也將使單細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展推向新的高度。

 
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參考文獻(xiàn)
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2. Patowary A, Zhang P, Jops C, Vuong CK, Ge X, Hou K, Kim M, Gong N, Margolis M, Vo D, Wang X, Liu C, Pasaniuc B, Li JJ, Gandal MJ, de la Torre-Ubieta L. Developmental isoform diversity in the human neocortex informs neuropsychiatric risk mechanisms. Science. 2024 May 24;384(6698):eadh7688. doi: 10.1126/science.adh7688. Epub 2024 May 24. PMID: 38781356; PMCID: PMC11960787.