抗體親和層析全解析：從結(jié)合原理到填料選擇的系統(tǒng)指南
抗體（Antibody）是機(jī)體針對抗原刺激產(chǎn)生的特異性免疫球蛋白（Ig），是體液免疫反應(yīng)的重要效應(yīng)分子�？贵w主要由兩條重鏈（heavy chain，H）和兩條輕鏈（light chain，L）組成（見Fig.1）。根據(jù)重鏈恒定區(qū)氨基酸組成和排列順序的不同，分為IgM、IgD、IgG、IgA 和IgE五類，其中IgG是治療性抗體中最常見的形式。
同一類的Ig，根據(jù)其鉸鏈區(qū)氨基酸組成和重鏈二硫鍵的數(shù)量及位置的不同，又分為不同的亞類（subclass），如人IgG可分為四個(gè)亞類，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。輕鏈可分為兩種，分別為kappa（κ）鏈和lambda（λ）鏈。據(jù)此，可將Ig分為兩型（type），即κ型和λ型。
圖1 IgG抗體結(jié)構(gòu)示意圖
隨著抗體藥物技術(shù)的不斷演進(jìn)，抗體類型與分子結(jié)構(gòu)日趨多樣化。
從傳統(tǒng)單抗（mAb）到雙抗（BsAb）、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）、抗體寡核苷酸偶聯(lián)體（AOC）及多價(jià)抗體等新分子形式層出不窮。
這些分子在 Fc 結(jié)構(gòu)、親和力、糖基化修飾及熱穩(wěn)定性 等方面存在顯著差異，
導(dǎo)致下游純化環(huán)節(jié)面臨新的挑戰(zhàn)：
• Protein A 結(jié)合差異增大：部分抗體或片段無法穩(wěn)定結(jié)合；
• 分子穩(wěn)定性更敏感：低 pH 洗脫易引發(fā)構(gòu)象變化或聚集；
• 雜質(zhì)性質(zhì)更接近：片段、聚集體及錯(cuò)配體在電荷、疏水性上與主峰相似，分離難度顯著增加；
• 工藝窗口更窄：對配基選擇、洗脫條件及清洗策略提出更高要求。
因此，開發(fā)兼顧高選擇性、溫和洗脫條件的親和層析工藝，成為抗體純化工藝優(yōu)化的關(guān)鍵方向。
抗體親和層析（Antibody Affinity Chromatography）是利用生物分子間特異性相互作用實(shí)現(xiàn)高選擇性分離的經(jīng)典方法。
最常用的配基為 Protein A——源自金黃色葡萄球菌的膜蛋白，可與抗體 Fc 區(qū)特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)一步捕獲與高純化。
天然 Protein A 含五個(gè) IgG 結(jié)合域，但也具有非特異結(jié)合片段，現(xiàn)代填料多采用基因改造型 Protein A，保留 Fc 結(jié)合功能的同時(shí)，顯著降低非特異吸附并增強(qiáng)其耐堿性。
此外，對于 Fab、IgM、抗體片段 等特殊分子，還可使用 Protein L（結(jié)合 κ 鏈）或 IgM 親和填料 進(jìn)行特異分離。
核心原理：利用抗體與配基的高親和結(jié)合 → 非目標(biāo)雜質(zhì)洗脫 → 調(diào)整 pH 實(shí)現(xiàn)可逆洗脫。
選擇合適的親和填料，是抗體純化工藝開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化放大的核心環(huán)節(jié)。
優(yōu)秀的填料不僅要具備良好的分離性能，還需兼顧放大可行性、長期穩(wěn)定性與供應(yīng)可靠性。
1.配基類型與結(jié)合特異性
不同親和配基識別的抗體結(jié)構(gòu)位點(diǎn)不同，合適配基的選擇是實(shí)現(xiàn)高選擇性捕獲的基礎(chǔ)。
• Protein A：與抗體的 Fc 區(qū)結(jié)合，適用于 IgG1、IgG2、IgG4 及多數(shù) Fc 融合蛋白，是當(dāng)前最主流的抗體捕獲配基；
• Protein L：識別 κ 輕鏈區(qū)域，適用于無 Fc 結(jié)構(gòu)的抗體片段（如 Fab、scFv）或Fc改造后的抗體及部分 IgA、IgM；
• Protein G：結(jié)合范圍更廣，可作為 Protein A 的補(bǔ)充，用于特殊亞型或部分Fab的結(jié)合；
• IgM ：識別多聚結(jié)構(gòu)域，能在高分子量條件下保持高選擇性分離。
不同抗體類型（IgG、IgM、IgA、雙抗、抗體片段等）需根據(jù)結(jié)合結(jié)構(gòu)、亞型及分子特性匹配合適配基，才能獲得最佳純度與回收率。
下圖展示了抗體親和填料選擇流程圖（圖2），可幫助研發(fā)人員在早期開發(fā)階段快速判斷適用填料類型與推薦產(chǎn)品：
圖2 抗體親和填料選擇流程圖
2.動(dòng)態(tài)結(jié)合載量（DBC）與分離平衡
DBC（Dynamic Binding Capacity） 反映填料在特定流速與保留時(shí)間下的結(jié)合能力，是評價(jià)抗體捕獲效率的重要指標(biāo)。
• DBC 高 → 捕獲通量提升、處理能力強(qiáng)，但可能導(dǎo)致分辨率下降或雜質(zhì)共洗脫；
• DBC 低 → 分離效果好但通量不足。
工藝開發(fā)中需在載量、流速、收率與純度之間找到平衡點(diǎn)，綜合考慮分離效率與工藝的經(jīng)濟(jì)性。
3.可放大性與壓力–流速性能
可放大性是衡量填料從實(shí)驗(yàn)室到生產(chǎn)規(guī)模平穩(wěn)過渡能力的關(guān)鍵。
部分填料在小試階段表現(xiàn)良好，但放大后因機(jī)械強(qiáng)度不足或柱床壓縮，出現(xiàn)運(yùn)行壓力上升、流速受限、柱床塌陷等問題，迫使客戶在中后期調(diào)整工藝或降低生產(chǎn)效率。
建議在早期開發(fā)階段就驗(yàn)證填料的壓力–流速表現(xiàn)與可用線速度窗口，確保放大后依然滿足通量與運(yùn)行壓力要求。
4.長期耐堿穩(wěn)定性
親和層析需經(jīng)受反復(fù)NaOH在位清洗（CIP），耐堿性能直接決定填料使用壽命與生產(chǎn)成本。
高耐堿性填料可承受 0.5–1.0 M NaOH 清洗數(shù)百循環(huán)而保持載量與性能穩(wěn)定，是實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定生產(chǎn)的關(guān)鍵。
5.批間一致性與供應(yīng)穩(wěn)定性
在工業(yè)化階段，層析填料不僅是純化工藝的關(guān)鍵耗材，更是保證生產(chǎn)穩(wěn)定、可控的重要組成部分。
填料的質(zhì)量批間一致性和穩(wěn)定供應(yīng)直接影響工藝的穩(wěn)健運(yùn)行與用戶終產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。
• 批間一致性：考察不同批次填料在關(guān)鍵性能等方面保持穩(wěn)定，以確保純化工藝在不同生產(chǎn)周期中具備良好的重復(fù)性和產(chǎn)品質(zhì)量一致性。若批次差異過大，可能導(dǎo)致目標(biāo)蛋白回收率波動(dòng)、雜質(zhì)譜變化或放大驗(yàn)證失敗。
• 供應(yīng)穩(wěn)定性：考察方向應(yīng)不僅包含供應(yīng)商持續(xù)、可靠的供貨能力，還應(yīng)包括供應(yīng)商在質(zhì)量管理體系、生產(chǎn)產(chǎn)能、工藝一致性驗(yàn)證及技術(shù)支持等方面的長期穩(wěn)定性。對于商業(yè)化生產(chǎn)企業(yè)而言，供應(yīng)鏈的穩(wěn)定與可持續(xù)性是維持生產(chǎn)穩(wěn)定運(yùn)行和風(fēng)險(xiǎn)可控的前提條件。
在親和填料篩選階段，應(yīng)將產(chǎn)品的批間一致性與供應(yīng)商的長期穩(wěn)定供貨能力納入綜合考量。
這不僅關(guān)系到物料性能的可重復(fù)性，也決定了工藝的穩(wěn)健性和最終產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性。
在抗體純化中，低 pH 洗脫可能引起抗體構(gòu)象變化和聚集。
使用 Novo-A Diamond 在 pH 4.0 條件下即可完全洗脫，純度 >94%，回收率 >95%，載量約 65 mg/mL（圖3）。
實(shí)驗(yàn)條件：
層析柱：EzScreen 4.4 mL（Bed height = 10 cm）
樣品：mAb 原樣，樣品濃度6.8 mg/mL
Binding buffer: 20mM Tris-HCl, 0.15M NaCl, pH 7.2
Wash buffer 1: 20mM NaAc，1 M NaCl, pH 7.2
Wash buffer 2: 20mM Tris-HCl, pH 7.2
Elution buffer 1: 50mM NaAc-HAc, pH 4.0
Elution buffer 2: 50mM NaAc-HAc, pH 3.5
圖3. Novo-A Diamond單抗純化層析及電泳圖譜。
結(jié)果表明：Novo-A Diamond 在溫和洗脫條件下仍具高捕獲能力，適合對低pH條件敏感抗體的純化。
抗體親和層析是單抗及其衍生分子下游純化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，理想的親和填料應(yīng)在 分離性能（DBC 與純度）、放大適配性（壓力–流速與耐堿性） 及供應(yīng)保障（批間一致性與供應(yīng)商能力）之間實(shí)現(xiàn)平衡。
在早期工藝開發(fā)階段充分評估這些維度，可有效避免后期因流速受限、配基衰減或供貨波動(dòng)引起的工藝變更與驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)。
| 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號 |
| AT Protein A Diamond Plus | 25mL | AA402305 |
| AT Protein A Diamond Ultra | 25mL | AA05701 |
| Novo-A Diamond | 25mL | AA05001 |
| Extrem A Diamond | 25mL | AA04501 |
| Diamond Protein L | 25mL | AA05101 |
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