Kilobaser DNA合成儀在 CRISPR/Cas9 基因編輯中的適用性研究

 

• 技術(shù)基礎(chǔ)：CRISPR/Cas9是 RNA 引導(dǎo)的基因編輯工具，體外應(yīng)用需通過轉(zhuǎn)錄 DNA 模板制備sgRNA，市售體外轉(zhuǎn)錄試劑盒可在30 分鐘內(nèi)完成 sgRNA 制備。
• 核心問題：轉(zhuǎn)錄試劑盒中的轉(zhuǎn)錄酶和脫氧核糖核酸酶會(huì)被 DNA 合成殘留物（鹽、保護(hù)基團(tuán)、截短寡核苷酸等）抑制。
• 解決方案：使用Kilobaser one-XT 合成儀合成 DNA 模板，搭配OliPure HIC 純化試劑盒去除殘留物。
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：純化后的 Kilobaser DNA 模板，與寡核苷酸供應(yīng)商提供的模板相比，轉(zhuǎn)錄的 sgRNA產(chǎn)量和功能完全一致，證明該組合可支持實(shí)驗(yàn)室自主 CRISPR/Cas9 基因編輯。

1. sgRNA 先與 Cas9 核酸酶結(jié)合，形成 Cas9-sgRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物會(huì)使 Cas9 進(jìn)入活性構(gòu)象，隨后掃描相鄰雙鏈 DNA 以尋找 3 個(gè)堿基對(duì)的 NGG 原間隔區(qū)相鄰序列（PAM）。
2. 結(jié)合 PAM 序列后，雙鏈 DNA 解旋，sgRNA 可與其中一條 DNA 鏈退火；若 PAM 附近 DNA 序列與 sgRNA 的 crRNA 序列充分互補(bǔ)，Cas9 會(huì)切割 DNA 靶標(biāo)，產(chǎn)生平端雙鏈斷裂。
3. 實(shí)際負(fù)責(zé)切割的是 Cas9 的兩個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)域：RuvC 結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割非互補(bǔ) DNA 鏈，HNH 結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割互補(bǔ) DNA 鏈。

1. 常規(guī)方案：用 NEB 的 EnGen® sgRNA 合成試劑盒，經(jīng) “寡核苷酸雜交→雙鏈 DNA 延伸→DNA 轉(zhuǎn)錄” 三步，1 小時(shí)內(nèi)合成 sgRNA，但需高質(zhì)量 DNA 模板。
2. 核心問題：Kilobaser 合成儀制備 DNA 模板時(shí)，會(huì)產(chǎn)生抑制轉(zhuǎn)錄酶、DNase 的殘留物（鹽、保護(hù)基團(tuán)等），影響 sgRNA 合成與功能。
3. 解決方案：用 OliPure HIC 純化試劑盒去除殘留物，可消除抑制作用。

1. DNA 模板：設(shè)計(jì) 55nt 序列（T7 啟動(dòng)子 + 5'-dG+crRNA+SpCas9 支架），用 Kilobaser 合成后分 “純化 / 未純化” 組，以供應(yīng)商模板為對(duì)照。
2. sgRNA 合成：純化組 sgRNA 產(chǎn)率（4~25μg）與供應(yīng)商模板一致，未純化組產(chǎn)率最低。
3. Cas9 活性檢測(cè)：純化組制備的 sgRNA 切割質(zhì)粒效率高（2.5kb 線性條帶明顯，未裂解質(zhì)粒少）；未純化組切割效率低；對(duì)照（僅 sgRNA / 僅 Cas9）無切割，證明 sgRNA 靶向有效。

關(guān)鍵問題與答案
問題 1：合成殘留物對(duì) CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的 sgRNA 制備及 Cas9 活性有哪些具體影響？如何解決這一問題？

• 影響：
• 抑制酶活性：殘留物（鹽、保護(hù)基團(tuán)、截短寡核苷酸）會(huì)抑制體外轉(zhuǎn)錄試劑盒中的轉(zhuǎn)錄酶（影響 sgRNA 合成效率）和脫氧核糖核酸酶（DNase I）影響 DNA 模板降解，導(dǎo)致 sgRNA 濃度測(cè)定不準(zhǔn)）；
  1. 降低 sgRNA 質(zhì)量：未純化模板轉(zhuǎn)錄的 sgRNA 產(chǎn)率最低（低于純化模板），且 Cas9 切割時(shí)未裂解質(zhì)粒比例高，切割效率顯著下降。
• 解決方案：使用OliPure HIC 純化試劑盒對(duì) Kilobaser 合成的 DNA 模板進(jìn)行純化，可完全去除殘留物，恢復(fù)酶活性，使 sgRNA 產(chǎn)率和切割效率與寡核苷酸供應(yīng)商模板一致。

• 優(yōu)勢(shì)：
  1. 自主性強(qiáng)：實(shí)驗(yàn)室可自主合成靶標(biāo)特異性 DNA 模板，無需等待供應(yīng)商交付，縮短實(shí)驗(yàn)周期；
  2. 成本與靈活性：可按需合成特定序列（如文檔中 55nt 的 CRISPR 專用模板），避免商業(yè)定制的批量限制，降低長(zhǎng)期使用成本；
  3. 質(zhì)量可控：純化后模板的 sgRNA 產(chǎn)量（4~25μg）和功能與商業(yè)模板完全一致，質(zhì)量有保障。
• 適用場(chǎng)景：頻繁使用 CRISPR/Cas9 技術(shù)的研究實(shí)驗(yàn)室，需長(zhǎng)期、靈活制備不同靶標(biāo) sgRNA 的場(chǎng)景。

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