DMF受限下綠色二元溶劑體系助力多肽高效合成

背景：DMF受限，綠色替代迫在眉睫
2023年12月，歐盟REACH法規(guī)正式將N,N-二甲基甲酰胺（DMF）列入限制清單，禁止其在多個(gè)領(lǐng)域中使用。DMF作為固相多肽合成（SPPS）中的“黃金溶劑”，因其優(yōu)異的極性和反應(yīng)效率被廣泛應(yīng)用，但其高毒性、對(duì)環(huán)境的持久性以及對(duì)操作人員的健康威脅，促使全球科研界加速尋找綠色、安全、性能相當(dāng)?shù)奶娲�溶劑�?/span>

最新突破：綠色二元溶劑體系 + 高溫感應(yīng)加熱合成策略
意大利佛羅倫薩大學(xué)與Gyros Protein Technologies公司聯(lián)合開展的研究，系統(tǒng)評(píng)估了多種綠色溶劑組合，最終提出以二甲基亞砜（DMSO）為核心的二元溶劑體系，結(jié)合PurePep® Chorus多肽合成儀的感應(yīng)加熱（Induction Heating, IH）技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)DMF的高效替代，并在多個(gè)挑戰(zhàn)性肽段的合成中表現(xiàn)出更優(yōu)或相當(dāng)?shù)暮铣尚�率與純度。

研究設(shè)計(jì)：從溶劑篩選到合成驗(yàn)證，層層遞進(jìn)
1 溶劑體系篩選與優(yōu)化
研究團(tuán)隊(duì)依據(jù)GSK綠色溶劑選擇指南，設(shè)定以下篩選標(biāo)準(zhǔn)：

• 氨基酸溶解度 ≥ 0.4 M
• 沸點(diǎn) > 100°C（防止高溫蒸發(fā)）
• 黏度 < 4 mPa·s（適配自動(dòng)化設(shè)備）
• 樹脂膨脹性 > 4 mL/g（保障反應(yīng)效率）

經(jīng)系統(tǒng)評(píng)估，最終優(yōu)選出以下三種二元溶劑組合：

2 模型肽合成驗(yàn)證：高溫顯著提升合成效率
研究選取三種模型肽進(jìn)行合成驗(yàn)證：

• ACP (65–74)：常用于評(píng)估合成效率的標(biāo)準(zhǔn)肽
• A10K：具有自組裝特性的聚丙氨酸肽
• AlaSTD：非挑戰(zhàn)性參考肽

合成結(jié)果：

圖 1 在 90°C 下，用不同溶劑體系合成的 ACP(65–74) 的 RP-UHPLC 色譜圖對(duì)比
 

圖 2 在90°C下，采用不同溶劑體系合成的聚丙氨酸（polyALA）的RP-UHPLC色譜圖對(duì)比

圖 3 90°C下，以不同溶劑體系合成的 AlaSTD 的 RP-UHPLC 色譜圖對(duì)比

結(jié)論：在高溫條件下，綠色溶劑體系不僅可實(shí)現(xiàn)對(duì)DMF的替代，更在多個(gè)模型肽的合成中顯著提升了粗品純度。

3 挑戰(zhàn)性肽段合成：β-淀粉樣肽與SARS-CoV-2 RBM
β-淀粉樣肽（1–42）

• 特點(diǎn)：42個(gè)氨基酸，極易聚集，合成難度大
• 合成條件：90°C，BuOAc/DMSO體系
• 結(jié)果：粗品純度達(dá)61.7%，優(yōu)于DMF（59.7%）
• 經(jīng)PEC®純化后，純度提升至84%

圖 4 使用 DMF 合成的粗品 β-淀粉樣蛋白 (1-42) 的 RP-UHPLC色譜圖

圖 5 使用 DMF 合成并經(jīng)PEC®處理后的 β-淀粉樣蛋白 (1-42) 的 RP-UHPLC 色譜圖

SARS-CoV-2 RBM（436–507）

• 特點(diǎn)：72個(gè)氨基酸，親水/疏水區(qū)域交替，β-折疊傾向強(qiáng)
• 合成策略：雙次耦合 + 雙倍當(dāng)量
• 結(jié)果：BuOAc/DMSO體系粗品純度達(dá)42.6%，優(yōu)于DMF（26.1%）
• 經(jīng)PEC®純化后，純度達(dá)71%

圖 6 使用 DMF 合成的72聚肽 RBM436-507 的 RP-UHPLC 譜圖

圖 7 使用 DMF 合成并經(jīng)PEC®處理后，72 聚肽 RBM436-507 的 RP-UHPLC 色譜圖

PurePep® Chorus：綠色合成的核心平臺(tái)
本研究所有合成實(shí)驗(yàn)均在PurePep® Chorus自動(dòng)化多肽合成儀上完成，其優(yōu)勢(shì)包括：

• 感應(yīng)加熱（IH）技術(shù)：升溫迅速、控溫精準(zhǔn)，適配所有溶劑體系
• 振蕩+氮?dú)饣旌希捍_保反應(yīng)均勻，減少副反應(yīng)
• 6通道并行合成：提升實(shí)驗(yàn)通量與重復(fù)性
• 兼容綠色溶劑：自動(dòng)校準(zhǔn)體積，適應(yīng)不同黏度
• 集成PEC®純化模塊：實(shí)現(xiàn)合成-純化一體化，大幅減少溶劑使用
• 消旋化（Racemization）評(píng)估：安全性可控

究對(duì)易消旋的組氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估：

• 使用DIC/Oxyma Pure耦合體系，在DMSO/BuOAc體系中，消旋水平與DMF相當(dāng)或更低
• 推薦使用Fmoc-His(Boc)-OH而非Fmoc-His(Trt)-OH，以進(jìn)一步降低消旋風(fēng)險(xiǎn)

圖 8 消旋研究

綠色純化：PEC®技術(shù)引領(lǐng)環(huán)保新方向
傳統(tǒng)RP-HPLC純化過程溶劑消耗大、廢液多。本研究引入PurePep EasyClean（PEC®）技術(shù)，采用可還原斷裂的連接子與功能化吸附樹脂，實(shí)現(xiàn)：

• 溶劑使用量減少約85%
• 純化時(shí)間縮短至7小時(shí)以內(nèi)
• 純度提升顯著：β-淀粉樣肽從62%提升至84%，RBM從43%提升至71%

總結(jié)：綠色合成不再是“可選項(xiàng)”，而是“必由之路”
本研究系統(tǒng)驗(yàn)證了一種基于DMSO的綠色二元溶劑體系，結(jié)合PurePep® Chorus合成平臺(tái)與PEC®純化技術(shù)，不僅成功擺脫了對(duì)DMF的依賴，更在合成效率、肽段純度、操作安全性與環(huán)境友好性方面實(shí)現(xiàn)了全面提升。