TR-FRET/FRET實(shí)驗(yàn)常見問題和解決方案及其在藥物研發(fā)中的應(yīng)用

FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer，熒光共振能量轉(zhuǎn)移）實(shí)驗(yàn)是一種基于兩個(gè)熒光分子之間距離依賴性能量傳遞的檢測技術(shù)，常用于研究生物大分子之間的相互作用或構(gòu)象變化。

TR-FRET（Time-Resolved FRET）是FRET的技術(shù)升級，通過引入時(shí)間分辨檢測（Time-Resolved Fluorescence, TRF），解決了傳統(tǒng)FRET中背景高、靈敏度低的問題，更適合復(fù)雜樣品和高通量實(shí)驗(yàn)。

TR-FRET在藥物研發(fā)流程中的應(yīng)用
一、 在藥物研發(fā)流程中的位置（從前到后）
1.靶點(diǎn)生物學(xué)與配體發(fā)現(xiàn)（Hit ID）：受體/酶配體結(jié)合或競爭結(jié)合、蛋白–蛋白相互作用(PPI)（適合可重組/可標(biāo)記體系）
2.初篩（HTS）：端點(diǎn)型（結(jié)合/位點(diǎn)占有）或活性型（如磷酸化水平）板式讀數(shù)，以 Z’、S/B、CV 評估穩(wěn)健性，規(guī)�；�篩庫
3.命中確認(rèn)（Hit Confirmation）：多重復(fù)+多點(diǎn)劑量反應(yīng)，去除熒光體、金屬螯合、表面活性引發(fā)的假信號
4.機(jī)理與選擇性（MOA/Selectivity）：競爭/非競爭判別、變構(gòu)征象、同系家族選擇性、變位點(diǎn)蛋白交叉驗(yàn)證
5.細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)占有（TE）/通路效應(yīng)：細(xì)胞TR-FRET TE：帶標(biāo)記的可逆探針 + 目標(biāo)蛋白（天然或標(biāo)簽化），量化細(xì)胞內(nèi) Kd/IC50(TE)
6.后期應(yīng)用：QC放行

二、常見TR-FRET應(yīng)用場景
1. 結(jié)合與占位（Biochemical / Cell-free）：供體標(biāo)記靶蛋白（或抗體），受體標(biāo)記示蹤配體（tracer），供體和受體形成近鄰，可以讀出信號。
2. 酶活/通路活性（Kinase/Phospho、Epi等）：cAMP、生物標(biāo)志物或被修飾底物（如磷酸化），用Eu/Tb抗體和受體標(biāo)二抗/標(biāo)簽抗體形成近鄰，供體和受體形成近鄰，可以讀出信號。
3. PPI/復(fù)合物結(jié)合：A供體+B受體；A–B結(jié)合，供體和受體形成近鄰，可以讀出信號。
4. PROTAC/分子膠（Ternary Complex）：E3供體+受體標(biāo)記POI，加入雙功能分子 ，組裝三元復(fù)合體，供體和受體形成近鄰，可以讀出信號。
5. 細(xì)胞內(nèi)Target Engagement（TE）：標(biāo)簽化靶蛋白（SNAP/Halo）+細(xì)胞可滲透受體標(biāo)示蹤配體；內(nèi)源蛋白+抗體對（一抗Tb，二抗受體，形成夾心復(fù)合物，檢測修飾/構(gòu)象）。

三、 TR-FRET和其它技術(shù)的對比

	靈敏度	動(dòng)態(tài)范圍	背景	通量	樣本	儀器	應(yīng)用
TR-FRET	ng–pg 級	4–5 log	小	免洗，高通量	15 µL	有時(shí)間分辨熒光模塊的酶標(biāo)儀	磷酸化蛋白、蛋白互作、cAMP等，可以測裂解液、血清
ELISA	ng–pg 級	2–3 log	小	需洗板，高通量	50 µL	酶標(biāo)儀	分泌蛋白，可以測裂解液、血清、血液等
化學(xué)發(fā)光/MSD	fg 級	4–5 log	幾乎為0	需洗板，高通量	60µL	MSD 專用儀器	多細(xì)胞因子檢測、血藥濃度
AlphaLISA	fg級	5 log	小	免洗	2µL	配備 680 nm 激光的酶標(biāo)儀	擅長大復(fù)合物（>200 nm）
表面等離子共振 SPR	pM 級親和力		無標(biāo)記、無背景	8–16 通道，通量小	50µL	SPR 芯片+儀器	高純度蛋白
FRET（CFP/YFP、GFP 配對）	ng–pg 級	4–5 log	干擾多年，受光漂白影響	通量小	10-50µL	共聚焦或?qū)拡鲲@微鏡	活細(xì)胞成像、定位研究

四、如何快速選擇檢測方式
1、有酶標(biāo)儀TR-FRET模塊，選擇TR-FRET，免洗、通量高、背景低、動(dòng)態(tài)范圍寬，是ELISA的“直接升級”。
2、需要極致靈敏度，選擇化學(xué)發(fā)光/MSD更成熟，檢測背景更低，可檢測健康人的血液樣本。
3、大分子復(fù)合物或極微量樣本，選擇AlphaLISA，可與TR-FRET互補(bǔ)。
4、想看實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)，選擇SPR，只看終點(diǎn)/初篩HTS，選擇TR-FRET成本和通量最佳。

TR-FRET實(shí)驗(yàn)常見問題解析
TR-FRET試劑盒雖然技術(shù)成熟、靈敏度高，但在實(shí)際使用中仍會(huì)出現(xiàn)問題。以下是問題、原因和辦法的匯總，可作為日常排錯(cuò)清單直接對照。

1.信號弱 / S:B 低 /Signal Window ＜ 2
表現(xiàn)：受體/供體比值（Ratio = 665/620 × 10⁴）未伴隨劑量濃度而明顯變化。
可能原因
•  供受體距離/構(gòu)型不佳；標(biāo)記密度低或位點(diǎn)不合適
•  酶標(biāo)儀時(shí)間門控不佳（Delay/Integration設(shè)置不匹配Eu/Tb壽命）
•  銪/鋱供體熒光標(biāo)記物過期、反復(fù)凍融或受光漂白

解決方案
•  直接讀供體通道（620 nm 左右），若本身熒光低，說明供體失效，應(yīng)更換
•  做陽性對照孔，驗(yàn)證儀器/試劑
•  優(yōu)化時(shí)間門控Delay（50–150 µs）、Integration（100–400 µs）到 Z′ 最大 的區(qū)域；固定后不要隨意變更
•  加 0.1% BSA/Casein + 0.01–0.05% Tween-20 提升穩(wěn)定與抗吸附

2．信號波動(dòng)大 / CV 高 / 板間漂移
可能原因
•  加樣誤差、微孔板邊緣蒸發(fā)、孵育時(shí)間漂移、溫度過高導(dǎo)致試劑失效
•  組件非特異吸附、聚集體干擾
•   酶標(biāo)儀配置不佳，光柵類型酶標(biāo)儀特異性不好
解決方案
•  使用板封膜，全程 20–22 ℃孵育，或把板子放在帶濕盒的恒溫箱
•  棄用外圈，改用 3 復(fù)孔內(nèi)圈布局
•  加表面惰化（BSA/Casein）與少量表活；必要時(shí)改高親水性板材
•  選擇濾光片類型酶標(biāo)儀

3．鉤狀效應(yīng)（Prozone/Hook）/鐘形曲線/高濃度反而信號降
解決方案：
•  整體下調(diào)抗體濃度，定位平臺區(qū)；保持在線性上升區(qū)。
•  調(diào)整樣本濃度（比如：細(xì)胞密度/上清液濃度/組織的量等），調(diào)至未達(dá)平臺區(qū)為止

4. 平衡未達(dá)成 / 慢結(jié)合 / 無信號
解決方案：延長孵育，可過夜。

5. 特殊樣本相關(guān)
•  血清/血漿/組織裂解液：信號低時(shí)，可延長時(shí)間或增加細(xì)胞濃度。
•  化合物干擾：帶共軛芳香環(huán)、熒光素骨架的小分子常自發(fā)熒光，若 665 nm 信號隨化合物遞增，直接排除或降低濃度。

6.常見問題與快速排錯(cuò)
•  信號弱/S:B（信噪比）低：提高標(biāo)記密度或選擇更高量子產(chǎn)率受體；優(yōu)化延時(shí)與積分窗。
•  漂移/批間差：固定讀數(shù)時(shí)間線（加樣→孵育→讀數(shù)），板內(nèi)“錨定”滴定孔做歸一化除理。
•  化合物干擾：若665nm信號隨化合物遞增，直接排除或降低濃度。
•  非特異聚集：低鹽+無表面活性環(huán)境下易出現(xiàn)假抑制，可以加0.01–0.05% Tween-20/Pluronic或加入0.1% BSA/Casein封閉。Buffer中有不溶沉淀是正�，F(xiàn)象。

TR-FRET試劑盒推薦
Bioauxilium是一家總部位于加拿大蒙特利爾的專業(yè)研發(fā)和生產(chǎn)TR-FRET技術(shù)試劑公司，其研發(fā)人員在TR-FRET技術(shù)領(lǐng)域深耕30余年。來自加拿大,不受關(guān)稅影響,貨期穩(wěn)定。Bioauxilium 在全球擁有諸多大型藥物研發(fā)公司和CRO的用戶，THUNDER™產(chǎn)品的卓越性能已經(jīng)廣泛得到TR-FRET用戶的好評和青睞。

THUNDER™提供胞內(nèi)磷酸化蛋白、總蛋白檢測，GPCR相關(guān)第二信使cAMP檢測，細(xì)胞因子及Biomarker檢測，以及適合Assay開發(fā)的標(biāo)簽抗體（ToolBox抗體）試劑等。

（1）細(xì)胞因子&生物標(biāo)志檢測
Human IFNγ 為例
THUNDER細(xì)胞因子檢測是基于雙抗體夾心法，標(biāo)記熒光供體和受體的IFNγ抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細(xì)胞上清中IFNγ結(jié)合，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進(jìn)而產(chǎn)生665nm熒光信號，熒光信號強(qiáng)度與IFNγ濃度成正比。全程僅需2h，免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。

Human IFNγ檢測范圍：32 – 30,000 pg/mL

圖：Human IFNγ檢測原理，流程及標(biāo)曲

（2）磷酸化蛋白檢測
THUNDER磷酸化蛋白和總蛋白檢測是基于雙抗體夾心法，標(biāo)記熒光供體和受體的蛋白抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細(xì)胞上清中目標(biāo)蛋白結(jié)合，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進(jìn)而產(chǎn)生665nm熒光信號，熒光信號強(qiáng)度與目標(biāo)蛋白濃度成正比。以磷酸化ERK為例，全程僅需4.5h，免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。

圖3. THUNDER磷酸化蛋白檢測原理示意圖

該試劑盒已通過驗(yàn)證，適用于HEK293、H358、MCF7和B淋巴細(xì)胞裂解液中磷酸化- ERK1 /2（T202/Y204）的相對定量。用EGF處理HEK293細(xì)胞（50000個(gè)細(xì)胞/孔）與不同梯度濃度的EGF在室溫下孵育10分鐘。數(shù)據(jù)顯示，EGF促進(jìn)ERK磷酸化。饑餓處理不同密度的H358細(xì)胞18個(gè)小時(shí)，用不同梯度濃度的RMC-4550在37℃下孵育60分鐘。數(shù)據(jù)顯示，RMC-4550可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點(diǎn)的磷酸化。用不同梯度濃度的L779,450處理不同密度的MCF7細(xì)胞，在37℃下孵育30分鐘。數(shù)據(jù)顯示，L779,450可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點(diǎn)的磷酸化。在不含血清的RPMI中重懸不同密度的B淋巴細(xì)胞，用不同梯度濃度的L779,450在室溫下孵育30分鐘。數(shù)據(jù)顯示，L779,450可以抑制ERK1/2蛋白T202/Y204位點(diǎn)的磷酸化。

圖. THUNDER Extreme Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)驗(yàn)證數(shù)據(jù)

FRET實(shí)驗(yàn)速查與排錯(cuò)指南

一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)四要點(diǎn)
1.熒光對選擇
•  原則：良好光譜重疊（供體發(fā)射+受體吸收）+足夠光譜分離（便于區(qū)分通道）+明亮/穩(wěn)定。
•  常見思路：CFP/YFP系、mTurquoise2/Venus、mTFP1/mCitrine、GFP/mCherry、Alexa488/Alexa555/568 等染料對。

2.標(biāo)記與構(gòu)建
•  蛋白質(zhì)FRET：連接位點(diǎn)、連接肽長度與柔性會(huì)影響距離/取向；盡量保留生物學(xué)功能，并做“拯救”或功能驗(yàn)證。
•  體外標(biāo)記：位點(diǎn)特異（如半胱氨酸、SNAP/CLIP、HaloTag），定量化標(biāo)記度（DOL）和供受體化學(xué)計(jì)量。

3.對照與標(biāo)準(zhǔn)品
•  供體單獨(dú)、受體單獨(dú)表達(dá)/標(biāo)記；
•  正對照：已知能FRET的融合構(gòu)建（如Donor–linker–Acceptor）；
•  負(fù)對照：斷裂/突變型或分離構(gòu)建（無FRET）；
•  若做定量，準(zhǔn)備校正因子。

4.成像/儀器設(shè)置
•  方案A：敏化發(fā)射FRET（SE-FRET；常規(guī)熒光顯微）；
•  方案B：受體光漂白FRET（AP-FRET；漂白受體后供體增強(qiáng)）；
•  方案C：壽命FRET（FLIM-FRET）。
•  單分子/總內(nèi)反射、流式FRET、板式讀數(shù)亦可按需求選擇。

二、常見問題與定位思路（Checklist）

1.FRET信號很弱/沒有
•  供受體距離>10 nm或取向不利 → 調(diào)整連接肽長度/柔性、改變標(biāo)記位點(diǎn)；
•  光漂白過快/信噪低 → 降低光強(qiáng)、短曝光、使用更亮更穩(wěn)的熒光團(tuán)；
•  表達(dá)量失衡（受體過量或供體過量）→ 調(diào)整轉(zhuǎn)染量/感染MOI，做化學(xué)計(jì)量優(yōu)化；
•  受體未成熟/折疊慢 → 更換熒光蛋白版本（如mTurquoise2、mNeonGreen、mScarlet等）或延長培養(yǎng)時(shí)間；
•  體系確實(shí)不發(fā)生相互作用 → 做陽性對照驗(yàn)證。

2.假陽性/虛高
•  光譜串?dāng)_未除干凈 → 用單標(biāo)樣本計(jì)算并應(yīng)用到每次實(shí)驗(yàn)；
•  交叉激發(fā)嚴(yán)重 → 調(diào)整濾光片/激發(fā)波長，或選更分離的熒光對；
•  背景/自發(fā)熒光高 → 做背景區(qū)扣除，選低自發(fā)熒光培養(yǎng)基（如Phenol Red–free）；
•  光毒/漂白導(dǎo)致形態(tài)變化 → 優(yōu)化光劑量與采集時(shí)長。

3.細(xì)胞內(nèi)定位改變導(dǎo)致結(jié)果不可比
•  供受體融合改變了靶蛋白定位/功能 → 加入Linker優(yōu)化、做功能學(xué)補(bǔ)救；
•  不同處理組表達(dá)水平差異巨大 → 正規(guī)化供體強(qiáng)度或用FLIM。

4.批間差/復(fù)現(xiàn)性差
•  每次都重做單標(biāo)定標(biāo)；
•  固定軟件/擬合流程（保存腳本與參數(shù)），記錄增益、激發(fā)功率、曝光。

5.FLIM擬合困難
•  壽命分布復(fù)雜（多指數(shù)） → 先做相位/調(diào)制法或擬合；
•  信噪不足 → 提高采集時(shí)間或做時(shí)間分箱；
•  漏擬合儀器響應(yīng)函數(shù)（IRF） → 采 IRF 或用參照樣品校正。

三、FRET技術(shù)應(yīng)用
1. 生物學(xué)機(jī)制研究（細(xì)胞/分子尺度）
•  蛋白相互作用（PPI）/二聚化：Ras–Raf、NF-κB 亞基結(jié)合、受體酪氨酸激酶誘導(dǎo)二聚化。
•  構(gòu)象變化（單分子或細(xì)胞內(nèi)）：核糖開關(guān)折疊、動(dòng)力蛋白步進(jìn)、離子通道開關(guān)。
•   膜融合/囊泡運(yùn)輸：SNARE 介導(dǎo)融合、病毒入侵。
•  力學(xué)張力/粘度與擁擠度：整合素/肌動(dòng)蛋白張力傳感器、細(xì)胞質(zhì)擁擠度探針。

2.活細(xì)胞信號傳導(dǎo)與代謝
•  離子/小分子動(dòng)態(tài)：Ca²⁺、cAMP、cGMP、葡萄糖/乳酸探針。
•  激酶/磷酸化事件：PKA、ERK、AKT。
•  蛋白水解/翻譯后修飾：Caspase 活性、SUMO/Ub 相關(guān)構(gòu)象變化。

3.核酸技術(shù)與分子診斷
•   qPCR 探針：SNP 分型、病原體定量
•   原位雜交（FRET-FISH）/核酸折疊：基因定位、二級結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)

4.高通量藥篩 & 結(jié)合測定
•  TR-FRET（時(shí)間分辨 FRET）/HTRF：受體–配體結(jié)合、蛋白–蛋白/蛋白–核酸干預(yù)篩選

5.材料與納米尺度“分子尺”
•  聚合物/納米顆粒組裝、DNA 折紙：納米結(jié)構(gòu)距離標(biāo)定、能量傳遞網(wǎng)絡(luò)

6.免疫分析與POC（床旁）方向
•  夾心免疫 FRET/近鄰依賴：激素/藥物/生物標(biāo)志物定量

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