揭秘雙抗細胞株構(gòu)建的理論與實踐
1. 雙特異性抗體的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)
隨著蛋白質(zhì)工程技術(shù)的不斷進步，雙/多特異性結(jié)構(gòu)類型也越發(fā)多樣：重鏈和輕鏈以不同數(shù)量和不同形式組合形成各式各樣的分子結(jié)構(gòu)。一般來說，雙特異性抗體根據(jù)是否包含可結(jié)晶片段（Fc）進行分類，藥代動力學、半衰期、Fc受體介導功能（如適用）和生物學活性等也會因分子結(jié)構(gòu)而有顯著差異。
我們還可將不同抗原結(jié)合位點（如scFv或Fab）與其他蛋白結(jié)構(gòu)域融合產(chǎn)生雙特異性抗體，從而進一步功能化。如今，臨床試驗中大多數(shù)候選藥物都是BiTE、DART、二聚體“杵臼結(jié)構(gòu)”("knob-in-hole")抗體。
由于雙抗或者多抗有著兩個或多個位點與靶細胞交互作用，可實現(xiàn)更多靶向結(jié)合，并通過重定向具有細胞毒性的免疫效應細胞來激活更多免疫反應，例如T細胞和自然殺傷（Natural Killer）細胞的雙重定向可以產(chǎn)生更顯著的靶向細胞毒性效應。另外，雙特異性抗體在多結(jié)合位點和不同通路的參與之下，還可以降低出現(xiàn)耐藥性的幾率。
然而，雙抗在生產(chǎn)工藝當中依然面臨諸多挑戰(zhàn)。
由于雙抗的結(jié)構(gòu)種類繁多，輕重鏈組合數(shù)非常多，需要在質(zhì)粒構(gòu)建就給出適合的解決方案。默克的CHOZN® GS和UCOE® 組合成熟，應用的雙抗成功案例非常多，可以大大提高前期摸索試驗的效率（數(shù)據(jù)見后文）。
雙抗結(jié)構(gòu)類型的復雜性意味著會對蛋白表達和制造工藝帶來諸多挑戰(zhàn)，包括表達量低、雜質(zhì)高、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定和蛋白質(zhì)聚集等。本文結(jié)合兩篇文章重點探討的就是如何借助新技術(shù)來解決雙抗分子細胞株開發(fā)中的難題。
2. 首先通過兩篇文獻來介紹如何通過鏈間平衡優(yōu)化雙抗的產(chǎn)量以及純度
對于共輕鏈的雙抗可以采取單載體或者雙載體的系統(tǒng)進行表達，如圖二所示，采用HCF-LC-HC的順序進行質(zhì)粒構(gòu)建，獲得的minipool產(chǎn)量和純度，分別只有200-400mg/L，33%的異源二聚體比例。
經(jīng)過將三條鏈的順序進行調(diào)整，對比各鏈間組合的雙抗表達量與異源二聚體的純度，如圖三可以看出，HCF-HC-LC-LC的表現(xiàn)最好，minipool的產(chǎn)量達到912mg/L，POI（Protein of Interest）純度達到93%。因此，在對雙抗分子進行細胞株開發(fā)的前，質(zhì)粒載體的構(gòu)建優(yōu)化是十分必要的。
對于一些十分難表達的分子，微小RNA（miRNA）的應用可以提高外源基因的表達。對于提高雙抗的表達有很大的幫助。它的原理主要涉及其在基因調(diào)控中的作用：
1） 靶向抑制因子；
2） 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子；
3） 增強mRNA的穩(wěn)定性；
4） 調(diào)節(jié)細胞信號通路，改善細胞生長特性；
5）調(diào)節(jié)翻譯因子。
根據(jù)研究，將CHO細胞進行細胞工程改造，過表達miRNA-557，可顯著提高抗體表達量。多個分子在CHO細胞中瞬轉(zhuǎn)的結(jié)果，如圖四顯示，miR-557都能提高抗體的表達40%以上。
在獲得瞬轉(zhuǎn)的結(jié)果，文章繼續(xù)探討穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后單克隆的表現(xiàn)，如圖五顯示，top克隆在表達量方面顯著提高，同時，細胞生長與代謝方面也具備一定優(yōu)勢。
3. CHOZN® +UCOE® 平臺表達雙抗分子
如上圖所示，默克UCOE®質(zhì)粒的元件介紹，可以同時表達雙表達框的質(zhì)粒，UCOE®序列作為持家基因的保守序列，可以顯著降低插入位點的甲基化水平，從而提高插入到任意位點的外源基因的表達。
我們在設(shè)計雙抗BCMA/CD3的四條鏈的質(zhì)粒時，將其定為雙質(zhì)粒表達，分別是UCOE-LC1-HC1和UCOE-LC2-HC2，兩個質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染比例為1：1。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后按照5000cell/well進行minipool鋪板8塊96孔板，并進行titer篩選，96孔板的表達如下圖所示：有效minipool有600個，top表達水平45mg/L左右。
經(jīng)過minipool的擴培，Top20 minipool的fedbatch結(jié)果如圖八所示，經(jīng)過對minipool的產(chǎn)量與雙抗純度的研究，選取2個高表達與高純度的minipool進行單克隆的篩選，最終一共鋪板16塊，克隆形成率22%，通過單克隆成像，分析有效克隆將近500個。96孔板的數(shù)據(jù)如圖九所示。
經(jīng)過克隆的擴培，進行Top30進行Fedbatch，如圖八所示，top克隆表達量3g/L，并最終進行了異源二聚體的比例分析，采用去糖分子量的質(zhì)譜方法，純度最高為85%。
注：紅色柱代表克隆來源于Minipool1，藍色柱來源于minipool2。Fedbatch培養(yǎng)基均為：EX-CELL® Advanced CHO Fed-batch培養(yǎng)基和Cellvento® ModiFeed Prime COMP。
以上是我們初步的雙抗測試結(jié)果，CHOZN® GS &UCOE® 平臺十分成熟，在低通量的篩選后，獲得較為突出的單克隆，在不經(jīng)過任何工藝優(yōu)化的前提下，獲得表達量3g/L，單體比例85%的雙抗單克隆。
4. 總結(jié)
綜上所述，雙抗的開發(fā)工藝十分復雜，可以更多的從分子設(shè)計，載體構(gòu)建等方面進行鏈間表達平衡的優(yōu)化。那么，將復雜問題簡單化，默克的CHOZN® GS + UCOE® 平臺可以作為優(yōu)質(zhì)的解決方案，提供完備的protocol與成熟的團隊支持。除此之外，CHOZN® GS & UCOE® 平臺在國內(nèi)外市場，對于單抗、融合蛋白以及雙抗等各種分子都有豐富的實際案例，雙抗經(jīng)過高通量篩選，工藝優(yōu)化后最高的實際案例能達到10g/L以上。
Reference：
Zhang, S., et al. (2015). Biotechnology Progress 31(4): 1077-1085.
Simon Fischer et.al. miRNA Engineering of CHO Cells Facilitates Production of Difficult-to-Express Proteins and Increases Success in Cell Line Development
Barbara Tevelev. Et. Al. Genetic rearrangement during site specific integration event facilitates cell line development of a bispecific molecule
[1] Labrijn, Aran F. , Maarten L. Janmaat,Janice M. Reichert and Paul W. H. I. Paren. Bispecific antibodies: amechanistic review of the pipeline. NatureReviews Drug Discovery. 18: 585–608 (2019).
[2] Global Bispecific Antibody Market to 2025:Drug Sales & Clinical Pipeline Insights with an $8 Billion MarketOpportunity. Research and Markets. 18 Jan. 2019. Web.
[3] Bispecific Antibodies Market - GlobalIndustry Insights, Trends, Outlook, and Opportunity Analysis, 2018-2026. Rep.Coherent Market Insights. Oct. 2019. Web.
[4] Bispecific Antibodies Market By Type(Immunoglobulin G (IgG) Like Molecule, Non Immunoglobulin G (IgG) LikeMolecule), by Application (Oncology, Autoimmune Disease, Others) - Growth,Future Prospects & Competitive Analysis, 2018 – 2026. Rep. CredenceResearch. Dec. 2018. Web.
隨著蛋白質(zhì)工程技術(shù)的不斷進步，雙/多特異性結(jié)構(gòu)類型也越發(fā)多樣：重鏈和輕鏈以不同數(shù)量和不同形式組合形成各式各樣的分子結(jié)構(gòu)。一般來說，雙特異性抗體根據(jù)是否包含可結(jié)晶片段（Fc）進行分類，藥代動力學、半衰期、Fc受體介導功能（如適用）和生物學活性等也會因分子結(jié)構(gòu)而有顯著差異。
我們還可將不同抗原結(jié)合位點（如scFv或Fab）與其他蛋白結(jié)構(gòu)域融合產(chǎn)生雙特異性抗體，從而進一步功能化。如今，臨床試驗中大多數(shù)候選藥物都是BiTE、DART、二聚體“杵臼結(jié)構(gòu)”("knob-in-hole")抗體。
圖一 不同類型的雙抗結(jié)構(gòu)圖
由于雙抗或者多抗有著兩個或多個位點與靶細胞交互作用，可實現(xiàn)更多靶向結(jié)合，并通過重定向具有細胞毒性的免疫效應細胞來激活更多免疫反應，例如T細胞和自然殺傷（Natural Killer）細胞的雙重定向可以產(chǎn)生更顯著的靶向細胞毒性效應。另外，雙特異性抗體在多結(jié)合位點和不同通路的參與之下，還可以降低出現(xiàn)耐藥性的幾率。
然而，雙抗在生產(chǎn)工藝當中依然面臨諸多挑戰(zhàn)。
由于雙抗的結(jié)構(gòu)種類繁多，輕重鏈組合數(shù)非常多，需要在質(zhì)粒構(gòu)建就給出適合的解決方案。默克的CHOZN® GS和UCOE® 組合成熟，應用的雙抗成功案例非常多，可以大大提高前期摸索試驗的效率（數(shù)據(jù)見后文）。
雙抗結(jié)構(gòu)類型的復雜性意味著會對蛋白表達和制造工藝帶來諸多挑戰(zhàn)，包括表達量低、雜質(zhì)高、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定和蛋白質(zhì)聚集等。本文結(jié)合兩篇文章重點探討的就是如何借助新技術(shù)來解決雙抗分子細胞株開發(fā)中的難題。
2. 首先通過兩篇文獻來介紹如何通過鏈間平衡優(yōu)化雙抗的產(chǎn)量以及純度
對于共輕鏈的雙抗可以采取單載體或者雙載體的系統(tǒng)進行表達，如圖二所示，采用HCF-LC-HC的順序進行質(zhì)粒構(gòu)建，獲得的minipool產(chǎn)量和純度，分別只有200-400mg/L，33%的異源二聚體比例。
圖二 雙抗的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和表現(xiàn)
經(jīng)過將三條鏈的順序進行調(diào)整，對比各鏈間組合的雙抗表達量與異源二聚體的純度，如圖三可以看出，HCF-HC-LC-LC的表現(xiàn)最好，minipool的產(chǎn)量達到912mg/L，POI（Protein of Interest）純度達到93%。因此，在對雙抗分子進行細胞株開發(fā)的前，質(zhì)粒載體的構(gòu)建優(yōu)化是十分必要的。
圖三 不同質(zhì)粒配對的蛋白表達和純度
對于一些十分難表達的分子，微小RNA（miRNA）的應用可以提高外源基因的表達。對于提高雙抗的表達有很大的幫助。它的原理主要涉及其在基因調(diào)控中的作用：
1） 靶向抑制因子；
2） 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子；
3） 增強mRNA的穩(wěn)定性；
4） 調(diào)節(jié)細胞信號通路，改善細胞生長特性；
5）調(diào)節(jié)翻譯因子。
根據(jù)研究，將CHO細胞進行細胞工程改造，過表達miRNA-557，可顯著提高抗體表達量。多個分子在CHO細胞中瞬轉(zhuǎn)的結(jié)果，如圖四顯示，miR-557都能提高抗體的表達40%以上。
圖四 瞬時轉(zhuǎn)染miRNA對抗體表達的影響
在獲得瞬轉(zhuǎn)的結(jié)果，文章繼續(xù)探討穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后單克隆的表現(xiàn)，如圖五顯示，top克隆在表達量方面顯著提高，同時，細胞生長與代謝方面也具備一定優(yōu)勢。
圖五 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miRNA對難表達分子和細胞生長的影響
3. CHOZN® +UCOE® 平臺表達雙抗分子
圖六 UCOE®質(zhì)粒結(jié)構(gòu)
如上圖所示，默克UCOE®質(zhì)粒的元件介紹，可以同時表達雙表達框的質(zhì)粒，UCOE®序列作為持家基因的保守序列，可以顯著降低插入位點的甲基化水平，從而提高插入到任意位點的外源基因的表達。
我們在設(shè)計雙抗BCMA/CD3的四條鏈的質(zhì)粒時，將其定為雙質(zhì)粒表達，分別是UCOE-LC1-HC1和UCOE-LC2-HC2，兩個質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染比例為1：1。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后按照5000cell/well進行minipool鋪板8塊96孔板，并進行titer篩選，96孔板的表達如下圖所示：有效minipool有600個，top表達水平45mg/L左右。
圖七 96孔板階段minipool表達量
經(jīng)過minipool的擴培，Top20 minipool的fedbatch結(jié)果如圖八所示，經(jīng)過對minipool的產(chǎn)量與雙抗純度的研究，選取2個高表達與高純度的minipool進行單克隆的篩選，最終一共鋪板16塊，克隆形成率22%，通過單克隆成像，分析有效克隆將近500個。96孔板的數(shù)據(jù)如圖九所示。
圖八 Top20 minipool搖管Fedbatch的表達結(jié)果
圖九 單克隆在96孔板的表達結(jié)果
經(jīng)過克隆的擴培，進行Top30進行Fedbatch，如圖八所示，top克隆表達量3g/L，并最終進行了異源二聚體的比例分析，采用去糖分子量的質(zhì)譜方法，純度最高為85%。
圖十 Top30單克隆在搖管中的Fedbatch結(jié)果
注：紅色柱代表克隆來源于Minipool1，藍色柱來源于minipool2。Fedbatch培養(yǎng)基均為：EX-CELL® Advanced CHO Fed-batch培養(yǎng)基和Cellvento® ModiFeed Prime COMP。
以上是我們初步的雙抗測試結(jié)果，CHOZN® GS &UCOE® 平臺十分成熟，在低通量的篩選后，獲得較為突出的單克隆，在不經(jīng)過任何工藝優(yōu)化的前提下，獲得表達量3g/L，單體比例85%的雙抗單克隆。
4. 總結(jié)
綜上所述，雙抗的開發(fā)工藝十分復雜，可以更多的從分子設(shè)計，載體構(gòu)建等方面進行鏈間表達平衡的優(yōu)化。那么，將復雜問題簡單化，默克的CHOZN® GS + UCOE® 平臺可以作為優(yōu)質(zhì)的解決方案，提供完備的protocol與成熟的團隊支持。除此之外，CHOZN® GS & UCOE® 平臺在國內(nèi)外市場，對于單抗、融合蛋白以及雙抗等各種分子都有豐富的實際案例，雙抗經(jīng)過高通量篩選，工藝優(yōu)化后最高的實際案例能達到10g/L以上。
Reference：
Zhang, S., et al. (2015). Biotechnology Progress 31(4): 1077-1085.
Simon Fischer et.al. miRNA Engineering of CHO Cells Facilitates Production of Difficult-to-Express Proteins and Increases Success in Cell Line Development
Barbara Tevelev. Et. Al. Genetic rearrangement during site specific integration event facilitates cell line development of a bispecific molecule
[1] Labrijn, Aran F. , Maarten L. Janmaat,Janice M. Reichert and Paul W. H. I. Paren. Bispecific antibodies: amechanistic review of the pipeline. NatureReviews Drug Discovery. 18: 585–608 (2019).
[2] Global Bispecific Antibody Market to 2025:Drug Sales & Clinical Pipeline Insights with an $8 Billion MarketOpportunity. Research and Markets. 18 Jan. 2019. Web.
[3] Bispecific Antibodies Market - GlobalIndustry Insights, Trends, Outlook, and Opportunity Analysis, 2018-2026. Rep.Coherent Market Insights. Oct. 2019. Web.
[4] Bispecific Antibodies Market By Type(Immunoglobulin G (IgG) Like Molecule, Non Immunoglobulin G (IgG) LikeMolecule), by Application (Oncology, Autoimmune Disease, Others) - Growth,Future Prospects & Competitive Analysis, 2018 – 2026. Rep. CredenceResearch. Dec. 2018. Web.
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