小鼠小腸類器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)操作流程及注意事項(xiàng)
想象一下，在實(shí)驗(yàn)室里培養(yǎng)出一個(gè)擁有完整結(jié)構(gòu)的"迷你小腸"或"微型大腦"？這不是科幻！類器官——這種神奇的"迷你器官"，正讓這一切成為現(xiàn)實(shí)，為疾病研究、新藥研發(fā)打開(kāi)了一扇全新的大門(mén)。
Section.01
類器官：研究背景
類器官是什么？
類器官是源自干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞的三維細(xì)胞聚集體。它能模擬真實(shí)器官的關(guān)鍵功能和復(fù)雜結(jié)構(gòu)，用來(lái)進(jìn)行疾病研究或藥物測(cè)試，結(jié)果比傳統(tǒng)方法更接近體內(nèi)的真實(shí)情況[1]。
類器官培養(yǎng)的意義是什么？
類器官的開(kāi)發(fā)對(duì)人體器官和組織功能的研究意義重大。這得益于這些微型器官能夠很好地展現(xiàn)人體生物學(xué)特性[2]。
小鼠小腸類器官被視為最經(jīng)典和成熟的類器官模型之一，這一定位根植于 Hans Clevers 教授團(tuán)隊(duì) 2009 年的開(kāi)創(chuàng)性工作。該團(tuán)隊(duì)首次實(shí)現(xiàn)了成年小腸干細(xì)胞在體外的類器官培養(yǎng)，為此領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。小鼠小腸類器官?gòu)V泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、藥物篩選、宿主-微生物互作、疾病建模等領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的二維 (2D) 培養(yǎng)系統(tǒng)相比，3D 類器官培養(yǎng)提供了一個(gè)更具生理相關(guān)性的模型[3][4]。
圖 1. 已建立的小鼠小腸類器官培養(yǎng)方法[5]。
類器官技術(shù)為核心疾病建模與個(gè)體化治療提供了強(qiáng)大平臺(tái)。該類模型能夠高度模擬出生缺陷、癌癥、傳染病、代謝性疾病等條件下的器官發(fā)育與疾病演進(jìn)過(guò)程。例如，血管類器官已被應(yīng)用于揭示糖尿病血管功能障礙的相關(guān)分子通路。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，類器官與器官芯片技術(shù)有望共同減少對(duì)傳統(tǒng)動(dòng)物模型的依賴，廣泛應(yīng)用于藥物篩選、毒理與藥理評(píng)估，最終推動(dòng)個(gè)體化治療的實(shí)現(xiàn)[6][7][8]。
Section.02
小腸類器官：培養(yǎng)指南
將 Lgr5+ 腸道干細(xì)胞包埋于基質(zhì)膠中，并利用含有 WENR (Wnt3a, EGF, Noggin, R-spondin 1) 因子的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，就成功構(gòu)建了腸道類器官模型。該模型不僅能實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的無(wú)限增殖，還再現(xiàn)了腸道上皮的細(xì)胞多樣性，從而為原位、實(shí)時(shí)觀察上皮發(fā)育與分化提供了理想平臺(tái)[9][10]。
圖 2. 從小鼠腸道隱窩生成類器官的步驟流程[9]。
實(shí)驗(yàn)步驟:
1. 小鼠腸隱窩的分離
(1) 將小鼠禁食過(guò)夜或禁食 24 小時(shí)，用二氧化碳窒息法對(duì) 5 至 8 周齡小鼠實(shí)施安樂(lè)死，在分離小腸和結(jié)腸之前，用 70% 乙醇擦拭小鼠皮毛進(jìn)行消毒。
(2) 切取約 18-20 cm 長(zhǎng)的近端小腸段。對(duì)于結(jié)腸部分，應(yīng)解剖約 3–6 cm 的腸段，切割位置宜選擇在盲腸下方數(shù)毫米及直腸上方數(shù)毫米處，以避免引入過(guò)多毒素及代謝廢物污染培養(yǎng)體系，同時(shí)考慮到近端結(jié)腸區(qū)域具有較高的干細(xì)胞密度。隨后，使用鑷子仔細(xì)清除腸段表面附著的脂肪殘留、血管及外膜組織。
(3) 將分離的腸段小心地放入一個(gè) 10 厘米的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中應(yīng)加入 10 mL 預(yù)冷 PBS，用 10 mL 毫升注射器和 21G 針頭，用預(yù)冷的 PBS 輕輕沖洗腸腔，直至所有糞便顆粒都被排出。
(4) 用剪刀縱向剪開(kāi)腸段，使之形成腸片，用預(yù)冷的 PBS 輕輕沖洗腸片。
(5) 將腸段切成約 2-5 mm 的小塊，轉(zhuǎn)移到裝有 25 mL 預(yù)冷 PBS 的 50 mL 離心管中。
(6) 用血清移液管輕柔地吹打腸段小塊五次。讓樣本靜置約 20 秒，使組織碎片依靠重力自然沉降到管底。
(7) 待碎片沉降后，棄去 PBS。然后，向離心管中重新加入 25 mL 預(yù)冷 PBS，重復(fù)步驟 (6) 和 (7) 直到剩余的 PBS 變得清澈透明為止。
(8) 棄去清澈的 PBS，將組織碎片重懸于 20 mL 0.05% 的胰蛋白酶 /EDTA 溶液中。將樣本在 37 ℃、轉(zhuǎn)速為 20 rpm 的旋轉(zhuǎn)搖床上孵育 20 分鐘。
(9) 棄去胰蛋白酶 /EDTA 溶液，用 10 mL 預(yù)冷的 0.1% BSA 溶液重懸碎片。用預(yù)先潤(rùn)濕的血清移液管輕柔地吹打碎片三次。
(10) 讓組織碎片自然沉降后，將樣本的上清液部分通過(guò)一個(gè) 70 μm 的細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，收集第一部分濾液。
(11) 向剩余的組織沉淀中加入 10 mL 0.1% BSA 溶液，用預(yù)先潤(rùn)濕的血清移液管輕柔地吹打碎片三次。重復(fù)步驟 (10)，收集第二部分濾液。
(12) 重復(fù)步驟 (9)(10)(11)，直至收集第五部分濾液。
(13) 將第四和第五部分濾液在 4-6 ℃、轉(zhuǎn)速為 300 g 的條件下離心 5 分鐘。棄去上清，將含有腸道隱窩的沉淀重懸于 5 mL DMEM/Nutrient Mixture F-12 培養(yǎng)基中。
(14) 取部分濾液樣本轉(zhuǎn)移到六孔板中，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察隱窩的質(zhì)量。
圖 3. 小鼠分離腸隱窩的樣本圖像[4]。
2. 從分離的小鼠腸隱窩中制備腸類器官
(1) 將隱窩重懸于 DMEM/Nutrient Mixture F-12 后，用預(yù)先潤(rùn)濕的微量移液器吸頭吸取 10 微升樣本，滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)分離物中的隱窩數(shù)量。
(2) 將隱窩分離物在 4-6 ℃、300 g 的條件下離心 5 分鐘，棄去上清。
(3) 將隱窩分離物重懸于 180 μL 的小鼠腸道類器官生長(zhǎng)培養(yǎng)基和基質(zhì)膠的 1:1 混合液中，并使用剪口吸頭充分混勻。
(4) 用剪口微量移液器吸頭，將培養(yǎng)基-基質(zhì)膠混合液 (每滴 30 μL) 滴加到六孔板的一個(gè)孔中，形成液滴穹頂，并將隱窩分離物包埋其中。
(5) 輕輕將培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)，在 37 ℃、5% CO2、80% 相對(duì)濕度的 CO2 培養(yǎng)箱中孵育 30 分鐘，使基質(zhì)膠聚合。
(6) 沿孔壁緩慢加入 2 mL 小鼠腸道類器官生長(zhǎng)培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)板放入 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(7) 每天更換培養(yǎng)基，直到類器官完全發(fā)育成熟。
圖 4. 腸類器官的形態(tài)發(fā)展[4]。
Section.03
小腸類器官培養(yǎng)：注意事項(xiàng)
1. 如果使用 0.25% 胰蛋白酶 /EDTA，則必須進(jìn)一步稀釋，以避免組織中的細(xì)胞損壞。
2. 與小腸相比，結(jié)腸中的腸道干細(xì)胞密度較低，因此建議使用兩個(gè)以上的結(jié)腸以提高細(xì)胞密度。
3. 小鼠腸道一定要剪的足夠碎，否則會(huì)影響隱窩的提取。
4. 血清移液器必須預(yù)先潤(rùn)濕，以防止腸碎片或腸隱窩粘附在移液器壁上。建議事先用 PBS 上下移液，作為潤(rùn)濕步驟。
5. 基質(zhì)膠一定要在冰上操作，室溫下很容易變稠或凝固�；|(zhì)膠與隱窩混懸時(shí)吹打也一定要輕柔，一旦混入氣泡，后期培養(yǎng)過(guò)程中很容易出現(xiàn)散膠甚至溶膠的現(xiàn)象。
6. 加培養(yǎng)基時(shí)，請(qǐng)勿直接滴加在基質(zhì)膠滴上，以免破壞膠滴。培養(yǎng)基在使用前也一定要恢復(fù)室溫，冷藏的培養(yǎng)基直接加入到培養(yǎng)孔中很容易破壞膠滴。
7. 為了加速 Matrigel 的完全凝固，可以預(yù)先將培養(yǎng)板在 37℃ 的 CO2 培養(yǎng)箱中加熱。
8. 類器官構(gòu)建后，類器官的表征是非常重要的，在鑒定類器官后可進(jìn)行下游應(yīng)用。初步可以通過(guò)顯微鏡和 H&E 染色觀察形態(tài)；然后可以用 Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該類器官是否表達(dá)相應(yīng)的 biomarker；基因測(cè)序可以鑒定所培養(yǎng)的類器官是否有某些特征丟失；對(duì)于部分類器官，還可以檢測(cè)其是否具有功能。
Section.04
小結(jié)
小鼠小腸類器官是一項(xiàng)革命性技術(shù)，通過(guò)在體外三維培養(yǎng)中模擬真實(shí)腸道結(jié)構(gòu)，為疾病研究、藥物篩選及發(fā)育生物學(xué)提供了無(wú)比接近體內(nèi)環(huán)境的強(qiáng)大平臺(tái)。成功培養(yǎng)小鼠小腸類器官，是精密操作、優(yōu)質(zhì)基質(zhì)膠與含有核心因子培養(yǎng)基三者結(jié)合的藝術(shù)。掌握其原理并嚴(yán)格把控細(xì)節(jié)，您就能在培養(yǎng)皿中重現(xiàn)一個(gè)生機(jī)勃勃的“迷你腸道”。
[1] Madeline A Lancaster, et al. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014 Jul 18;345(6194):1247125.
[2] Hans Clevers, et al. Optimization of human small intestinal organoids. 23 August 2022.
[3] Toshiro Sato, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009 May 14;459(7244):262-5.
[4] Lei Chen, et al. Mouse Small Intestinal Organoid Cultures. Methods Mol Biol. 2025:2951:77-90.
[5] Marta Campillo Poveda, et al. Generation, culture, and stimulation of small intestinal murine organoids in parasitology research. STAR Protoc. 2023 Dec 15;4(4):102608.
[6] Katia Cheaito, et al. Establishment and characterization of prostate organoids from treatment-na?ve patients with prostate cancer. Oncol Lett. 2022 Jan;23(1):6.
[7] Sarah E Blutt, et al. Organoid Models for Infectious Disease. Annu Rev Med. 2022 Jan 27:73:167-182.
[8] Reiner A Wimmer, et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 2019 Jan;565(7740):505-510.
[9] ?züm Begüm B?ke, et al. Mouse Intestinal Organoid Culture Protocol. Methods Mol Biol. 2025 Jan 9.
[10] Magdalena Kasendra, et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Sci Rep. 2018 Feb 13;8(1):2871.
Section.01
類器官：研究背景
類器官是什么？
類器官是源自干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞的三維細(xì)胞聚集體。它能模擬真實(shí)器官的關(guān)鍵功能和復(fù)雜結(jié)構(gòu)，用來(lái)進(jìn)行疾病研究或藥物測(cè)試，結(jié)果比傳統(tǒng)方法更接近體內(nèi)的真實(shí)情況[1]。
類器官培養(yǎng)的意義是什么？
類器官的開(kāi)發(fā)對(duì)人體器官和組織功能的研究意義重大。這得益于這些微型器官能夠很好地展現(xiàn)人體生物學(xué)特性[2]。
小鼠小腸類器官被視為最經(jīng)典和成熟的類器官模型之一，這一定位根植于 Hans Clevers 教授團(tuán)隊(duì) 2009 年的開(kāi)創(chuàng)性工作。該團(tuán)隊(duì)首次實(shí)現(xiàn)了成年小腸干細(xì)胞在體外的類器官培養(yǎng)，為此領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。小鼠小腸類器官?gòu)V泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、藥物篩選、宿主-微生物互作、疾病建模等領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的二維 (2D) 培養(yǎng)系統(tǒng)相比，3D 類器官培養(yǎng)提供了一個(gè)更具生理相關(guān)性的模型[3][4]。
圖 1. 已建立的小鼠小腸類器官培養(yǎng)方法[5]。類器官技術(shù)為核心疾病建模與個(gè)體化治療提供了強(qiáng)大平臺(tái)。該類模型能夠高度模擬出生缺陷、癌癥、傳染病、代謝性疾病等條件下的器官發(fā)育與疾病演進(jìn)過(guò)程。例如，血管類器官已被應(yīng)用于揭示糖尿病血管功能障礙的相關(guān)分子通路。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，類器官與器官芯片技術(shù)有望共同減少對(duì)傳統(tǒng)動(dòng)物模型的依賴，廣泛應(yīng)用于藥物篩選、毒理與藥理評(píng)估，最終推動(dòng)個(gè)體化治療的實(shí)現(xiàn)[6][7][8]。
Section.02
小腸類器官：培養(yǎng)指南
將 Lgr5+ 腸道干細(xì)胞包埋于基質(zhì)膠中，并利用含有 WENR (Wnt3a, EGF, Noggin, R-spondin 1) 因子的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，就成功構(gòu)建了腸道類器官模型。該模型不僅能實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的無(wú)限增殖，還再現(xiàn)了腸道上皮的細(xì)胞多樣性，從而為原位、實(shí)時(shí)觀察上皮發(fā)育與分化提供了理想平臺(tái)[9][10]。
圖 2. 從小鼠腸道隱窩生成類器官的步驟流程[9]。實(shí)驗(yàn)步驟:
1. 小鼠腸隱窩的分離
(1) 將小鼠禁食過(guò)夜或禁食 24 小時(shí)，用二氧化碳窒息法對(duì) 5 至 8 周齡小鼠實(shí)施安樂(lè)死，在分離小腸和結(jié)腸之前，用 70% 乙醇擦拭小鼠皮毛進(jìn)行消毒。
(2) 切取約 18-20 cm 長(zhǎng)的近端小腸段。對(duì)于結(jié)腸部分，應(yīng)解剖約 3–6 cm 的腸段，切割位置宜選擇在盲腸下方數(shù)毫米及直腸上方數(shù)毫米處，以避免引入過(guò)多毒素及代謝廢物污染培養(yǎng)體系，同時(shí)考慮到近端結(jié)腸區(qū)域具有較高的干細(xì)胞密度。隨后，使用鑷子仔細(xì)清除腸段表面附著的脂肪殘留、血管及外膜組織。
(3) 將分離的腸段小心地放入一個(gè) 10 厘米的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中應(yīng)加入 10 mL 預(yù)冷 PBS，用 10 mL 毫升注射器和 21G 針頭，用預(yù)冷的 PBS 輕輕沖洗腸腔，直至所有糞便顆粒都被排出。
(4) 用剪刀縱向剪開(kāi)腸段，使之形成腸片，用預(yù)冷的 PBS 輕輕沖洗腸片。
(5) 將腸段切成約 2-5 mm 的小塊，轉(zhuǎn)移到裝有 25 mL 預(yù)冷 PBS 的 50 mL 離心管中。
(6) 用血清移液管輕柔地吹打腸段小塊五次。讓樣本靜置約 20 秒，使組織碎片依靠重力自然沉降到管底。
(7) 待碎片沉降后，棄去 PBS。然后，向離心管中重新加入 25 mL 預(yù)冷 PBS，重復(fù)步驟 (6) 和 (7) 直到剩余的 PBS 變得清澈透明為止。
(8) 棄去清澈的 PBS，將組織碎片重懸于 20 mL 0.05% 的胰蛋白酶 /EDTA 溶液中。將樣本在 37 ℃、轉(zhuǎn)速為 20 rpm 的旋轉(zhuǎn)搖床上孵育 20 分鐘。
(9) 棄去胰蛋白酶 /EDTA 溶液，用 10 mL 預(yù)冷的 0.1% BSA 溶液重懸碎片。用預(yù)先潤(rùn)濕的血清移液管輕柔地吹打碎片三次。
(10) 讓組織碎片自然沉降后，將樣本的上清液部分通過(guò)一個(gè) 70 μm 的細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，收集第一部分濾液。
(11) 向剩余的組織沉淀中加入 10 mL 0.1% BSA 溶液，用預(yù)先潤(rùn)濕的血清移液管輕柔地吹打碎片三次。重復(fù)步驟 (10)，收集第二部分濾液。
(12) 重復(fù)步驟 (9)(10)(11)，直至收集第五部分濾液。
(13) 將第四和第五部分濾液在 4-6 ℃、轉(zhuǎn)速為 300 g 的條件下離心 5 分鐘。棄去上清，將含有腸道隱窩的沉淀重懸于 5 mL DMEM/Nutrient Mixture F-12 培養(yǎng)基中。
(14) 取部分濾液樣本轉(zhuǎn)移到六孔板中，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察隱窩的質(zhì)量。
圖 3. 小鼠分離腸隱窩的樣本圖像[4]。2. 從分離的小鼠腸隱窩中制備腸類器官
(1) 將隱窩重懸于 DMEM/Nutrient Mixture F-12 后，用預(yù)先潤(rùn)濕的微量移液器吸頭吸取 10 微升樣本，滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，計(jì)數(shù)分離物中的隱窩數(shù)量。
(2) 將隱窩分離物在 4-6 ℃、300 g 的條件下離心 5 分鐘，棄去上清。
(3) 將隱窩分離物重懸于 180 μL 的小鼠腸道類器官生長(zhǎng)培養(yǎng)基和基質(zhì)膠的 1:1 混合液中，并使用剪口吸頭充分混勻。
(4) 用剪口微量移液器吸頭，將培養(yǎng)基-基質(zhì)膠混合液 (每滴 30 μL) 滴加到六孔板的一個(gè)孔中，形成液滴穹頂，并將隱窩分離物包埋其中。
(5) 輕輕將培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)，在 37 ℃、5% CO2、80% 相對(duì)濕度的 CO2 培養(yǎng)箱中孵育 30 分鐘，使基質(zhì)膠聚合。
(6) 沿孔壁緩慢加入 2 mL 小鼠腸道類器官生長(zhǎng)培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)板放入 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(7) 每天更換培養(yǎng)基，直到類器官完全發(fā)育成熟。
圖 4. 腸類器官的形態(tài)發(fā)展[4]。Section.03
小腸類器官培養(yǎng)：注意事項(xiàng)
1. 如果使用 0.25% 胰蛋白酶 /EDTA，則必須進(jìn)一步稀釋，以避免組織中的細(xì)胞損壞。
2. 與小腸相比，結(jié)腸中的腸道干細(xì)胞密度較低，因此建議使用兩個(gè)以上的結(jié)腸以提高細(xì)胞密度。
3. 小鼠腸道一定要剪的足夠碎，否則會(huì)影響隱窩的提取。
4. 血清移液器必須預(yù)先潤(rùn)濕，以防止腸碎片或腸隱窩粘附在移液器壁上。建議事先用 PBS 上下移液，作為潤(rùn)濕步驟。
5. 基質(zhì)膠一定要在冰上操作，室溫下很容易變稠或凝固�；|(zhì)膠與隱窩混懸時(shí)吹打也一定要輕柔，一旦混入氣泡，后期培養(yǎng)過(guò)程中很容易出現(xiàn)散膠甚至溶膠的現(xiàn)象。
6. 加培養(yǎng)基時(shí)，請(qǐng)勿直接滴加在基質(zhì)膠滴上，以免破壞膠滴。培養(yǎng)基在使用前也一定要恢復(fù)室溫，冷藏的培養(yǎng)基直接加入到培養(yǎng)孔中很容易破壞膠滴。
7. 為了加速 Matrigel 的完全凝固，可以預(yù)先將培養(yǎng)板在 37℃ 的 CO2 培養(yǎng)箱中加熱。
8. 類器官構(gòu)建后，類器官的表征是非常重要的，在鑒定類器官后可進(jìn)行下游應(yīng)用。初步可以通過(guò)顯微鏡和 H&E 染色觀察形態(tài)；然后可以用 Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該類器官是否表達(dá)相應(yīng)的 biomarker；基因測(cè)序可以鑒定所培養(yǎng)的類器官是否有某些特征丟失；對(duì)于部分類器官，還可以檢測(cè)其是否具有功能。
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[1] Madeline A Lancaster, et al. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014 Jul 18;345(6194):1247125.
[2] Hans Clevers, et al. Optimization of human small intestinal organoids. 23 August 2022.
[3] Toshiro Sato, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009 May 14;459(7244):262-5.
[4] Lei Chen, et al. Mouse Small Intestinal Organoid Cultures. Methods Mol Biol. 2025:2951:77-90.
[5] Marta Campillo Poveda, et al. Generation, culture, and stimulation of small intestinal murine organoids in parasitology research. STAR Protoc. 2023 Dec 15;4(4):102608.
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