細(xì)胞器互作解析膜接觸位點(diǎn) (MCS)，助力新藥開(kāi)發(fā)、臨床治療和預(yù)防

圖 1. 三類(lèi)囊泡運(yùn)輸通路的示意圖，箭頭指示囊泡運(yùn)輸方向^[1]。
已經(jīng)較為明確的包膜蛋白所介導(dǎo)的囊泡運(yùn)輸途徑。包膜蛋白 ii (cOPii；綠色) 形成用于從內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 向高爾基體進(jìn)行順向運(yùn)輸?shù)哪遗荩欢?cOPi (紅色) 則形成用于高爾基體內(nèi)部運(yùn)輸以及從高爾基體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行逆向運(yùn)輸?shù)哪遗�。殼蛋�?(藍(lán)色) 基于其與不同銜接蛋白 (APs) 的結(jié)合而形成多個(gè)復(fù)合物。與 AP1 和 AP3 結(jié)合的殼蛋白形成用于從跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)到后續(xù)內(nèi)吞細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)哪遗�，以及�?lái)自早期內(nèi)吞細(xì)胞器的運(yùn)輸；與 AP2 結(jié)合的殼蛋白則形成從質(zhì)膜產(chǎn)生的運(yùn)輸至早期內(nèi)體的囊泡。

詹姆斯·羅斯曼 (James E. Rothman)、蘭迪·謝克曼 (Randy W. Schekman) 和托馬斯·聚德霍夫 (Thomas C. Südhof) 3 位科學(xué)家也因發(fā)現(xiàn)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制——細(xì)胞中的主要運(yùn)輸系統(tǒng)——被授予 2013 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

然而，細(xì)胞器的功能遠(yuǎn)比科學(xué)家預(yù)想的要復(fù)雜得多。

因?yàn)�！�?xì)胞器并非是孤立的，而是作為動(dòng)態(tài)互作的整體。所有細(xì)胞器之間都存在功能性的緊密接觸，這些接觸通常被稱(chēng)為膜接觸位點(diǎn) (MCS)^[2]。

Section.01
膜接觸位點(diǎn) (MCS)

膜接觸位點(diǎn) (Membrane contact sites, MCS)：指兩個(gè)細(xì)胞器在不發(fā)生膜融合前提下的緊密相互作用區(qū)域 (通常在30-50 nm以?xún)?nèi)，但有時(shí)更遠(yuǎn)）。將細(xì)胞器固定在 MCS 處的蛋白質(zhì)復(fù)合物可以插入 MCS 處的細(xì)胞器內(nèi)部，也可以與相對(duì)膜上的蛋白質(zhì)或脂質(zhì)結(jié)合。這些復(fù)合物通常被稱(chēng)為系鏈，除了物理連接之外，它們?cè)谶@些位點(diǎn)通常還具有其他功能，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線(xiàn)粒體接觸位點(diǎn)促進(jìn) Ca2? 轉(zhuǎn)移、線(xiàn)粒體分裂、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和脂質(zhì)代謝。
 
圖 2. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線(xiàn)粒體接觸結(jié)構(gòu)（ERMES）介導(dǎo)的 MCS 由連接兩個(gè)膜的橋狀結(jié)構(gòu)組成^[3]。 
數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，在 ER 和線(xiàn)粒體的 MCS 處，存在許多密集的橋梁狀結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)跨越兩個(gè)細(xì)胞器之間的間隙，整體長(zhǎng)度為 24.2 nm ± 4.76 nm。

MCS 的運(yùn)輸機(jī)制

膜接觸位點(diǎn) (MCS) 在膽固醇和其他脂質(zhì)在細(xì)胞區(qū)室間的非囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)中起著核心作用。這種轉(zhuǎn)運(yùn)需要一種稱(chēng)為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (LTP) 的蛋白質(zhì)，其特征是能夠在體外促進(jìn)膜間的脂質(zhì)交換。

LTP 家族結(jié)構(gòu)多樣，但其作用機(jī)制大致可分為兩類(lèi)：脂質(zhì)穿梭轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和形成脂質(zhì)通道的蛋白。大多數(shù)穿梭轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在一個(gè)疏水裂隙或溝槽中結(jié)合單個(gè)脂質(zhì)單體。在某些情況下，結(jié)合的脂質(zhì)還被一個(gè)蓋結(jié)構(gòu)域屏蔽，使其與水相隔絕。這些 LTP 可以從膜中提取脂質(zhì)，將其轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)水相，并遞送到另一膜 (圖 3A)。許多 LTP 還具有輔助結(jié)構(gòu)域，使其定位到接觸位點(diǎn)。

圖 3. 膜接觸位點(diǎn)促進(jìn)細(xì)胞器之間的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移^[2]。
(A) 具有疏水溝槽或口袋的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從供體細(xì)胞器膜 (藍(lán)色) 中提取磷脂，并催化其轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞器膜 (灰色)。疏水溝槽在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中保護(hù)脂質(zhì)免受胞質(zhì)溶膠的影響。(B) 具有管狀疏水通道的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體形成穩(wěn)定的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移途徑，用于在系留細(xì)胞器膜之間轉(zhuǎn)移脂質(zhì)。(C) 脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膜接觸位點(diǎn) (MCS) 處調(diào)節(jié)細(xì)胞器膜的脂質(zhì)組成。盡管內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 中的膽固醇水平遠(yuǎn)低于高爾基體，但 OSBP 仍能將膽固醇從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，OSBP 將高爾基體脂質(zhì) PI4P 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膽固醇進(jìn)行交換。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，PI4P 水解為 PI 以維持較大的 PI4P 濃度梯度。

近幾年，人們發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)新的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (LTP) 家族，其作用機(jī)制似乎有所不同。該家族中的蛋白質(zhì)被稱(chēng)為 Vps13 樣蛋白或重復(fù) β-溝槽 (RBG) 基序橋狀蛋白，它們被認(rèn)為能夠形成大型 (10-25 nm) 的剛性結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有貫穿整個(gè)蛋白質(zhì)長(zhǎng)度的疏水溝槽 (圖 3B)。

此外，磷脂酰肌醇 (PIP) 及其前體在膜接觸位點(diǎn) (MCS) 的運(yùn)輸需要在這些位點(diǎn)發(fā)揮作用的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (LTP) (圖 3C)。

隨著細(xì)胞器之間接觸位點(diǎn)的逐步揭示，我們對(duì)細(xì)胞器功能及其整合運(yùn)作方式也有了新的認(rèn)識(shí)，許多銜接蛋白已被鑒定，但肯定還有更多有待發(fā)現(xiàn)！

如何鑒別 MCS 處的銜接蛋白？

Schuldiner 和 Einat Zalckvar 團(tuán)隊(duì)曾系統(tǒng)地繪制了酵母細(xì)胞中所有的接觸點(diǎn)，并展示了一種鑒別銜接蛋白的方法。他們?cè)谘芯繄?bào)道中選擇基于雙分子熒光互補(bǔ)分析 (Bimolecular fluorescence complementation assay)——可視化已知接觸位點(diǎn)的有力工具——系統(tǒng)地鑒定和表征細(xì)胞器之間的接觸位點(diǎn)。

簡(jiǎn)而言之，使用了一種分裂式熒光探針，Venus 熒光蛋白的一半包被每個(gè)細(xì)胞器的周邊。在兩個(gè)細(xì)胞器之間的接觸位點(diǎn)區(qū)域，兩半 Venus 熒光蛋白相互作用，形成完整的熒光團(tuán) (圖 4）。
 

圖 4. 分裂型 Venus 接觸位點(diǎn)報(bào)告蛋白的示意圖^[4]。
作者將 Venus 熒光蛋白(VN)的一半與定位于一個(gè)細(xì)胞器的膜蛋白融合，并將 Venus 蛋白的另一半(VC)與定位于另一個(gè)細(xì)胞器的膜蛋白融合。只有當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞器彼此靠近時(shí)，例如在接觸位點(diǎn)，才會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)。

細(xì)胞器膜接觸位點(diǎn)的存在表明，定位于兩個(gè)不同細(xì)胞器的因子可以聚集在一起，協(xié)同參與細(xì)胞器的附加功能^[5]。接下來(lái)，我們一起來(lái)看幾種常見(jiàn)的細(xì)胞器互作~

Section.02
細(xì)胞器的相互作用

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線(xiàn)粒體

細(xì)胞器的相互作用通常發(fā)生在膜接觸位點(diǎn) (MCSs)，其中以膜性細(xì)胞器內(nèi)質(zhì)網(wǎng)最為核心。同時(shí)，線(xiàn)粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是最早被觀察到也是研究最多的細(xì)胞器互作類(lèi)型，通過(guò)熒光顯微鏡和電子顯微鏡可以觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體在多個(gè)接觸位點(diǎn)連接在一起形成特定區(qū)域，稱(chēng)為線(xiàn)粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)膜 (Mitochondriaassociated membrane，MAM)^[2]。

雖然內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體膜緊密接觸形成特定的接觸位點(diǎn)，但兩個(gè)細(xì)胞器并不融合，其結(jié)構(gòu)、功能和特性都得到了保留。

圖 5. 大鼠肝細(xì)胞中存在豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線(xiàn)粒體接觸位點(diǎn)^[2]。

MAM 是對(duì)細(xì)胞生理?xiàng)l件十分敏感的一種高度可變的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，其在動(dòng)態(tài)過(guò)程中保持正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)依賴(lài)于某些作為物理連接的蛋白質(zhì)分子，主要包括鈣離子通道 IP3 受體 (IP3R)、分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 75 (Grp75)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線(xiàn)粒體相遇結(jié)構(gòu)復(fù)合體 (Endoplasmic reticulum mitochondria encounter structure,ERMES) 以及線(xiàn)粒體融合蛋白 2 (MFN2) 等。此外, MAM 內(nèi)還含有其他多種蛋白，與協(xié)調(diào) Ca²⁺ 轉(zhuǎn)移、ROS 的產(chǎn)生、凋亡誘導(dǎo)以及脂質(zhì)代謝相關(guān) (圖 6)。

除了線(xiàn)粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與作為分泌途徑中央分選和加工站的高爾基體、以及在細(xì)胞內(nèi)吞、胞吐和自噬作用等過(guò)程中發(fā)揮重要作用的溶酶體也存在相互作用 (圖 6）。

圖 6. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-細(xì)胞器膜接觸位點(diǎn) (ＭＣSs) 蛋白分子機(jī)制圖^[5]。

表 1. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-細(xì)胞器 MCSs 蛋白的特點(diǎn)、功能及相關(guān)疾病^[5]。

超高分辨熒光成像實(shí)驗(yàn)還揭示了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)線(xiàn)粒體的形態(tài)構(gòu)造的調(diào)控作用，線(xiàn)粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸區(qū)域表現(xiàn)出明確的收縮，為后續(xù)線(xiàn)粒體的分裂鋪墊^[6]。
 

圖 7.  A. 線(xiàn)粒體 (綠色) 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (洋紅色) 的接觸；B. 僅線(xiàn)粒體綠色通道。白色箭頭指示線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸位點(diǎn)的線(xiàn)粒體收縮和分裂^[6]。

線(xiàn)粒體-溶酶體

線(xiàn)粒體和溶酶體調(diào)控著眾多生物學(xué)過(guò)程，這些過(guò)程對(duì)于維持營(yíng)養(yǎng)和代謝穩(wěn)態(tài)以及細(xì)胞整體活力至關(guān)重要。研究表明，與之前研究過(guò)的其他細(xì)胞器類(lèi)似，線(xiàn)粒體和溶酶體也會(huì)通過(guò)特殊的膜接觸位點(diǎn) (MCS) 進(jìn)行通訊，這些位點(diǎn)被稱(chēng)為線(xiàn)粒體-溶酶體接觸(Mitochondria-lysosome contacts，MLC），它們促進(jìn)彼此間的動(dòng)態(tài)相互作用，而無(wú)需膜融合。

通過(guò) MLC 進(jìn)行的信號(hào)整合參與了關(guān)鍵過(guò)程，包括線(xiàn)粒體的分裂和動(dòng)態(tài)變化，以及鈣、膽固醇和氨基酸的交換。
 

圖 8. 在出芽酵母中，線(xiàn)粒體 (M) 與溶酶體等效液泡 (v) 形成 MCS^[2]。

此外，線(xiàn)粒體-溶酶體相互作用功能障礙也會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)生。線(xiàn)粒體和溶酶體的相互作用是控制線(xiàn)粒體質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。當(dāng)自噬過(guò)程受阻時(shí)，胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)化失衡，ROS 含量上升，細(xì)胞受到嚴(yán)重的氧化應(yīng)激刺激導(dǎo)致死亡，該過(guò)程發(fā)生在神經(jīng)元細(xì)胞中導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病如 AD、PD 的發(fā)生，發(fā)生在胰島 β 細(xì)胞中則會(huì)影響胰島素分泌導(dǎo)致肥胖及胰島素抵抗。

圖 9.表達(dá) LAMP1-mGFP (溶酶體) 和 mApple-TOM20 (外部線(xiàn)粒體外膜) 的活體 HeLa 細(xì)胞內(nèi)溶酶體-線(xiàn)粒體互作的表征^[7]。
A.溶酶體-線(xiàn)粒體近距離接觸；B.溶酶體吞噬線(xiàn)粒體。

Section.03
細(xì)胞器互作的表征

細(xì)胞器互作短暫迅速且相當(dāng)微觀，即使知道其存在，想要實(shí)現(xiàn)表征也并不容易，下面我們通過(guò)圖像和表格來(lái)對(duì)比以下幾種主流方式的優(yōu)缺點(diǎn)。

表 2. 表征細(xì)胞器互作的實(shí)驗(yàn)方法、圖示及其優(yōu)缺點(diǎn)。
 

案例實(shí)操

下面讓我們來(lái)看一例 MCE 產(chǎn)品標(biāo)記細(xì)胞器的文獻(xiàn)實(shí)操。Su 等人報(bào)道了短鏈酰基-COA 脫氫酶 (short-chain acyl-CoA dehydrogenase, SCAD) 通過(guò)乙酰輔酶 A 依賴(lài)的脂噬通路加速衰老相關(guān)的肝臟脂肪變性，文中使用 BODIPY 493/503 (HY‐W090090) 和 LysoTracker Red (HY‐D1300) 分別對(duì) HepG2 細(xì)胞中的脂滴和溶酶體進(jìn)行標(biāo)記和共定位分析。

圖 10. AD-Acds 大幅減弱了脂滴與溶酶體的共定位^[9]。
A.LysoTracker Red 標(biāo)記溶酶體與 BODIPY 493/503 標(biāo)記脂滴的共定位熒光圖像；B.LysoTracker Red 標(biāo)記溶酶體與 BODIPY 493/503 標(biāo)記脂滴的共定位定量分析。

MCE 提供各類(lèi)細(xì)胞器熒光標(biāo)記染料，可以滿(mǎn)足對(duì)不同細(xì)胞器的多通道染色需求，助力您的研究。

Section.04
小結(jié)

隨著細(xì)胞器互作的研究深入，相信會(huì)有越來(lái)越多的 MCSs 會(huì)被發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)疾病狀態(tài)下 MCSs 介導(dǎo)的細(xì)胞器互作變化的研究，可以進(jìn)步深入的闡明疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)相關(guān)的調(diào)控靶點(diǎn)，對(duì)于新藥開(kāi)發(fā)、臨床治療和預(yù)防有重要意義。