亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)超高分辨顯微成像系列：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光染料簡(jiǎn)單介紹

共聚焦顯微鏡以激光作為光源，激發(fā)組織細(xì)胞中熒光標(biāo)記的分子和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)器收集信號(hào)從而進(jìn)行高分辨率的成像。因此我們對(duì)不同熒光染料分別進(jìn)行簡(jiǎn)單的介紹，幫助大家更快速地選擇合適的染料。這一期我們將對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光染料進(jìn)行簡(jiǎn)單的介紹。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的概念

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是由扁囊、小管或小泡連接形成的三維網(wǎng)狀膜系統(tǒng)，約占細(xì)胞總膜面積的 50%，是真核細(xì)胞中最多的膜，有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（附著核糖體）和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（未附著核糖體）兩種形式，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在脂質(zhì)合成和蛋白合成、蛋白伴侶和折疊以及鈣穩(wěn)態(tài)中具有核心作用。

1、DiOC6(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)綠色熒光探針

DiOC6(3)(碘代3,3'-二己氧基羰花青) 是較為傳統(tǒng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色方式，它是一種親脂性羰花青染料, 由兩個(gè)苯并氧雜環(huán)通過(guò)共軛雙鍵連接，每個(gè)環(huán)上連接兩個(gè)己基（C6）鏈，其平面結(jié)構(gòu)中的共振鍵導(dǎo)致正電荷離域，產(chǎn)生熒光特性，具有細(xì)胞膜透性。這種染料的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為：484/501nm。在高濃度（1-5μM）時(shí)，可穿透其他細(xì)胞膜，用來(lái)對(duì)活細(xì)胞和固定細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行染色。此外，DiOC6(3)在低濃度（10-20nM）時(shí)，會(huì)累積在線粒體（因線粒體有較高的負(fù)膜電位ΔΨm），因此也可用于檢測(cè)活細(xì)胞的線粒體膜電位變化。

2、ER-Tracker內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅/綠色熒光探針

ER-Tracker Red/Green是一種具有細(xì)胞膜通透性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)紅/綠色熒光探針，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有高度選擇性，可以用于活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性熒光染色。ER-Tracker Red/Green為采用Molecular Probes公司的BODIPY TR進(jìn)行了熒光標(biāo)記的glibenclamide。Glibenclamide即glyburide（格列苯脲：一種磺酰脲酶），是一種2型糖尿病治療藥物，可以結(jié)合主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的包含ATP敏感的鉀離子通道(KATP channel)的磺脲類(lèi)(sulphonylurea)受體。熒光標(biāo)記的glibenclamide可用作內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性的熒光探針。ER-Tracker Red呈紅色熒光，檢測(cè)時(shí)的最大激發(fā)波長(zhǎng)為587nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為615nm；ER-Tracker Green呈綠色熒光，檢測(cè)時(shí)最大激發(fā)光波長(zhǎng)為504nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為511nm。相比傳統(tǒng)的DiOC6(3)染料對(duì)于細(xì)胞的毒性而言，ER-Tracker Red對(duì)于細(xì)胞的毒性極低。但這種染料適用于活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光染色，卻不適合用于固定細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熒光染色。

3、AIE-ER

AIE-ER 是一種特異性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 熒光探針 (綠色熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為405 nm, 發(fā)射光波長(zhǎng)為450~650 nm)，AIE-ER 探針中的分子在溶液中通常熒光較弱或不發(fā)光，但當(dāng)它們聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中時(shí)，由于分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)受限等原因，會(huì)誘導(dǎo)熒光發(fā)射增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特異性熒光標(biāo)記。它的特點(diǎn)是具有優(yōu)異的靶向特異性，能精準(zhǔn)識(shí)別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；顯著的光穩(wěn)定性，不易發(fā)生光漂白；高亮度，熒光信號(hào)強(qiáng)；低工作濃度，可在較低濃度下實(shí)現(xiàn)有效標(biāo)記，且對(duì)細(xì)胞的毒性較小。一方面可用于活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的實(shí)時(shí)成像，便于觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和分布變化，另一方面，可作為研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)疾病的工具，通過(guò)標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，深入了解疾病的發(fā)病機(jī)制。

4、ER Flipper-TR 28

ER Flipper-TR 28 是一種帶有小分子熒光基團(tuán)的 Flipper 探針，可用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜張力成像。其結(jié)構(gòu)中含有五氟.苯基基團(tuán)，并且可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面面向細(xì)胞質(zhì)的蛋白質(zhì)硫醇反應(yīng)。ER Flipper-TR 28 探針通過(guò)其機(jī)械感受基團(tuán)中兩個(gè)扭曲的二噻吩并噻吩之間的扭轉(zhuǎn)角度和偏振的變化來(lái)感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脂質(zhì)雙層膜的組織變化，進(jìn)而反映膜張力的變化。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜處于緊張狀態(tài)時(shí)，二噻吩并噻吩呈并排狀態(tài)，探針的發(fā)射壽命較長(zhǎng)，為 4.1-8.0ns；而在松弛狀態(tài)下，二噻吩并噻吩呈扭曲狀態(tài)，發(fā)射壽命較短，為 2.0-4.0ns。它具有寬吸收和發(fā)射光譜，通�？梢杂� 488nm 激光進(jìn)行激發(fā)，發(fā)射光在 575-625nm 之間，能夠自發(fā)地插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脂質(zhì)膜中，且只在插入膜中時(shí)才會(huì)發(fā)出熒光，因此具有良好的靶向性和低背景熒光。此外，該探針適用于活細(xì)胞成像，對(duì)細(xì)胞的毒性較小。

5、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色的應(yīng)用

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色技術(shù)通過(guò)特異性標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，使我們能更直觀地研究其形態(tài)、功能及病理狀態(tài)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)病理診斷、藥物研發(fā)三大核心領(lǐng)域，同時(shí)在農(nóng)業(yè)科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等交叉領(lǐng)域也有延伸應(yīng)用。

在細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)研究方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色能通過(guò)對(duì)其形態(tài)動(dòng)態(tài)觀察和亞細(xì)胞定位的研究，從而解析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)與功能的關(guān)系。

在醫(yī)學(xué)病理診斷方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色技術(shù)能加深我們對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）與疾病機(jī)制的研究，通過(guò)觀察應(yīng)激狀態(tài)下的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)改變和應(yīng)激通路驗(yàn)證來(lái)揭示病理狀態(tài)下的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常。

在藥物研發(fā)方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色技術(shù)能通過(guò)藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證和藥物毒性檢測(cè)來(lái)篩選藥物靶點(diǎn)并檢測(cè)藥物的安全性，有效助力藥物研發(fā)與其毒性評(píng)估。

A549細(xì)胞：

Dapi（405通道）

線粒體Mito-tracker（488通道）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染料（555通道）
 

Merge

Hela細(xì)胞：

Dapi（405通道）
 

線粒體Mito-tracker（488通道）
 

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（555通道）
 

Merge

中心（公司）超高分辨率激光共聚焦顯微鏡平臺(tái)搭建的Leica Stellaris 5超高分辨率激光共聚焦系統(tǒng)，具有22mm均勻大視場(chǎng)及8K超高清掃描分辨率兩大優(yōu)勢(shì)，同時(shí)搭載Power HyD檢測(cè)器，可實(shí)現(xiàn)更高的光子探測(cè)效率。整合的多層智能模塊體系，包含精準(zhǔn)自聚焦、全景拼圖、多維時(shí)序成像以及光譜解碼等功能組件，尤其配備專(zhuān)業(yè)級(jí)共定位分析與智能三維重構(gòu)系統(tǒng)，通過(guò)模組化擴(kuò)展設(shè)計(jì)持續(xù)賦能生命科學(xué)探索新邊界。