同位素標(biāo)記技術(shù)揭示衣康酸在肺泡巨噬細(xì)胞中的促炎作用
衣康酸——巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的代謝物，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為其有抗炎作用。近期 Cell Metabolism 研究發(fā)現(xiàn)，衣康酸在肺泡巨噬細(xì)胞中會(huì)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)在該機(jī)制發(fā)現(xiàn)中起了關(guān)鍵作用......
Section.01
衣康酸: “人設(shè)崩塌”？
衣康酸 (Itaconate) 是巨噬細(xì)胞在免疫激活時(shí)通過(guò)免疫應(yīng)答基因 1 (IRG1) 途徑合成的重要代謝產(chǎn)物。科學(xué)界普遍認(rèn)為衣康酸具有顯著的抗炎作用，能夠抑制炎癥，減少炎癥因子如 IL-6、IL-12 的生成。
然而，Shan 等研究團(tuán)隊(duì)最新發(fā)表在 Cell Metabolism 上的突破性研究得出了一個(gè)相反的結(jié)論：在組織駐留的肺泡巨噬細(xì)胞 (AMs) 中，衣康酸反而表現(xiàn)出促炎作用，顯著增強(qiáng)了 NLRP3 炎癥小體的活化，促進(jìn) IL-1β 等促炎細(xì)胞因子的釋放。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，衣康酸的處理會(huì)加重 LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷，提示在特定微環(huán)境下，衣康酸可能“火上澆油”!
圖 1. 研究示意圖[1]。
這顛覆了我們對(duì)它一貫的“抗炎印象”，研究人員是如何發(fā)現(xiàn)這一重要實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的呢？本期我們就一起分析下~
Section.02
衣康酸促炎: 文獻(xiàn)研究思路
Shan 等研究團(tuán)隊(duì)采用代謝流分析技術(shù) (Metabolic flux analysis，MFA)，通過(guò)使用全 13C 標(biāo)記的谷氨酰胺 (Glutamine-13C5) 示蹤實(shí)驗(yàn)，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS) 和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 連用技術(shù)，精確追蹤了衣康酸在肺泡巨噬細(xì)胞 (AMs) 中代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制，明確解釋了衣康酸是如何在 AMs 中促進(jìn)炎癥的過(guò)程，具體的實(shí)驗(yàn)的過(guò)程為：
一、細(xì)胞模型構(gòu)建
- 肺泡巨噬細(xì)胞 (AMs) 分離：從小鼠肺組織中分離 AMs，純度高于 95%。
- 骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞 (BMDMs) 培養(yǎng)：通過(guò)體外培養(yǎng)骨髓細(xì)胞獲取。
二、同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)
標(biāo)記策略：使用 glutamine-13C5 進(jìn)行代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)；在無(wú)血清 DMEM 培養(yǎng)基中添加 2mM glutamine-13C5 替換普通谷氨酰胺。
標(biāo)記時(shí)間：細(xì)胞在 37℃、5% CO2 條件下孵育 4 h。
實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組：僅用 LPS (100 ng/Ml) 刺激 4 h;衣康酸處理組：衣康酸 (7.5 mM) 預(yù)處理 3 h，再 LPS 刺激 4 h；自然豐度對(duì)照組：為標(biāo)記的普通谷氨酰胺培養(yǎng)基，用于本地校正。
圖 2. 在用或未用 ITA (7.5 mM) 預(yù)處理的巨噬細(xì)胞 (AMs) 中，隨后用 LPS (500 ng/mL) 刺激 3 小時(shí)后，檢測(cè)到的全 13C 標(biāo)記琥珀酸 (H)，以及 全 13C 標(biāo)記琥珀酸與全 13C 標(biāo)記的富馬酸之比。[2]
三、代謝物提取與衍生化
快速淬滅代謝反應(yīng)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，快速用液氮速凍細(xì)胞，終止代謝活動(dòng)。
代謝物提�。�使用 80% 甲醇 (-80℃ 預(yù)冷) 裂解細(xì)胞，離心后收集上清液；采用凍干法濃縮代謝物。
衍生化處理 (GC-MS 分析)：代謝物經(jīng) MOX 試劑 (甲氧胺鹽酸鹽) 和 MSTFA (硅烷化試劑) 衍生，提升 GC-MS 檢測(cè)靈敏度。
四、質(zhì)譜分析
GC-MS 檢測(cè)：檢測(cè)衣康酸、琥珀酸、富馬酸等 TCA 循環(huán)中間產(chǎn)物。
LC-MS/MS：MRM，定量 13C 標(biāo)記代謝物。
五、數(shù)據(jù)分析
代謝流計(jì)算：使用 MetaboAnalyst 5.0 和 SIMCA-P 進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)算 13C 標(biāo)記比例，解析代謝通量變化 (如琥珀酸→富馬酸)。
關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：衣康酸顯著抑制琥珀酸脫氫酶 (SDH) ，導(dǎo)致 13C-琥珀酸堆積； AMs 通過(guò)增強(qiáng)線粒體復(fù)合物 I (ETC-CI) 活性補(bǔ)償能量缺口，進(jìn)而激活炎癥信號(hào)。
Section.03
同位素標(biāo)記物---科研核心工具
在研究人員探索衣康酸是促進(jìn)細(xì)胞炎癥的過(guò)程中，穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)發(fā)揮了不可或缺的貢獻(xiàn)！
精準(zhǔn)解析代謝動(dòng)態(tài)變化
傳統(tǒng)代謝組學(xué)僅能測(cè)定代謝物靜態(tài)濃度，而 13C 穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)可動(dòng)態(tài)追蹤谷氨酰胺 -13C5 在 TCA 循環(huán)中的流向，明確衣康酸抑制 SDH 的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)；通過(guò)計(jì)算 13C 標(biāo)記代謝物的同位素豐度分布，精確評(píng)估代謝通量變化。
區(qū)分內(nèi)源與外源代謝貢獻(xiàn)
通過(guò) 13C 標(biāo)記的琥珀酸與未標(biāo)記物的對(duì)比，排除實(shí)驗(yàn)干擾，確認(rèn)衣康酸直接作用于 SDH ；證實(shí)衣康酸特異性誘導(dǎo) AMs 發(fā)生代謝重編程，而 BMDMs 未出現(xiàn)相同的代謝表型。
揭示細(xì)胞類型特異性調(diào)控機(jī)制
同位素示蹤數(shù)據(jù)表明，AMs 因肺泡微環(huán)境特性 (如低氧、低葡萄糖) 主要依賴氧化磷酸化供能，而 BMDMs 以糖酵解為主；衣康酸通過(guò)抑制 SDH 導(dǎo)致 AMs 中琥珀酸累積，進(jìn)而通過(guò)以下機(jī)制觸發(fā)促炎效應(yīng)：琥珀酸介導(dǎo)的線粒體 ROS 生成增加、激活 HIF-1α 信號(hào)通路及促進(jìn) NLRP3 炎癥小體組裝與活化。這些發(fā)現(xiàn)建立了代謝物動(dòng)態(tài)變化與炎癥反應(yīng)調(diào)控的直接分子關(guān)聯(lián)。
技術(shù)靈敏度高
GC-MS 與 LC-MS/MS 的結(jié)合使用，全面覆蓋 TCA 循環(huán)中關(guān)鍵中間體及其代謝物，檢測(cè)靈敏度高范圍寬。
關(guān)于 MCE
Section.04
小結(jié)
作者采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)，明確解釋了衣康酸并非“萬(wàn)能抗炎分子”，其在肺泡巨噬細(xì)胞中的促炎作用警示臨床開(kāi)發(fā)需謹(jǐn)慎；通過(guò)同位素標(biāo)記技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)認(rèn)知發(fā)起了挑戰(zhàn)，對(duì)靶向治療打開(kāi)了一個(gè)全新思路，如通過(guò)抑制 ETC-CI 或 SDH 活性可能成為緩解肺損傷的一個(gè)治療靶點(diǎn)。未來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)和同位素示蹤方法的不斷進(jìn)步，同位素標(biāo)記技術(shù)將會(huì)能夠更深入、更精細(xì)地解析一些細(xì)胞和組織層面的代謝網(wǎng)絡(luò)，從而為理解疾病的本質(zhì)、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)提供更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
Section.01
衣康酸: “人設(shè)崩塌”？
衣康酸 (Itaconate) 是巨噬細(xì)胞在免疫激活時(shí)通過(guò)免疫應(yīng)答基因 1 (IRG1) 途徑合成的重要代謝產(chǎn)物。科學(xué)界普遍認(rèn)為衣康酸具有顯著的抗炎作用，能夠抑制炎癥，減少炎癥因子如 IL-6、IL-12 的生成。
然而，Shan 等研究團(tuán)隊(duì)最新發(fā)表在 Cell Metabolism 上的突破性研究得出了一個(gè)相反的結(jié)論：在組織駐留的肺泡巨噬細(xì)胞 (AMs) 中，衣康酸反而表現(xiàn)出促炎作用，顯著增強(qiáng)了 NLRP3 炎癥小體的活化，促進(jìn) IL-1β 等促炎細(xì)胞因子的釋放。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，衣康酸的處理會(huì)加重 LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷，提示在特定微環(huán)境下，衣康酸可能“火上澆油”!
圖 1. 研究示意圖[1]。這顛覆了我們對(duì)它一貫的“抗炎印象”，研究人員是如何發(fā)現(xiàn)這一重要實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的呢？本期我們就一起分析下~
Section.02
衣康酸促炎: 文獻(xiàn)研究思路
Shan 等研究團(tuán)隊(duì)采用代謝流分析技術(shù) (Metabolic flux analysis，MFA)，通過(guò)使用全 13C 標(biāo)記的谷氨酰胺 (Glutamine-13C5) 示蹤實(shí)驗(yàn)，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS) 和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS) 連用技術(shù)，精確追蹤了衣康酸在肺泡巨噬細(xì)胞 (AMs) 中代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制，明確解釋了衣康酸是如何在 AMs 中促進(jìn)炎癥的過(guò)程，具體的實(shí)驗(yàn)的過(guò)程為：
一、細(xì)胞模型構(gòu)建
- 肺泡巨噬細(xì)胞 (AMs) 分離：從小鼠肺組織中分離 AMs，純度高于 95%。
- 骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞 (BMDMs) 培養(yǎng)：通過(guò)體外培養(yǎng)骨髓細(xì)胞獲取。
二、同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)
標(biāo)記策略：使用 glutamine-13C5 進(jìn)行代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)；在無(wú)血清 DMEM 培養(yǎng)基中添加 2mM glutamine-13C5 替換普通谷氨酰胺。
標(biāo)記時(shí)間：細(xì)胞在 37℃、5% CO2 條件下孵育 4 h。
實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組：僅用 LPS (100 ng/Ml) 刺激 4 h;衣康酸處理組：衣康酸 (7.5 mM) 預(yù)處理 3 h，再 LPS 刺激 4 h；自然豐度對(duì)照組：為標(biāo)記的普通谷氨酰胺培養(yǎng)基，用于本地校正。
圖 2. 在用或未用 ITA (7.5 mM) 預(yù)處理的巨噬細(xì)胞 (AMs) 中，隨后用 LPS (500 ng/mL) 刺激 3 小時(shí)后，檢測(cè)到的全 13C 標(biāo)記琥珀酸 (H)，以及 全 13C 標(biāo)記琥珀酸與全 13C 標(biāo)記的富馬酸之比。[2]三、代謝物提取與衍生化
快速淬滅代謝反應(yīng)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，快速用液氮速凍細(xì)胞，終止代謝活動(dòng)。
代謝物提�。�使用 80% 甲醇 (-80℃ 預(yù)冷) 裂解細(xì)胞，離心后收集上清液；采用凍干法濃縮代謝物。
衍生化處理 (GC-MS 分析)：代謝物經(jīng) MOX 試劑 (甲氧胺鹽酸鹽) 和 MSTFA (硅烷化試劑) 衍生，提升 GC-MS 檢測(cè)靈敏度。
四、質(zhì)譜分析
GC-MS 檢測(cè)：檢測(cè)衣康酸、琥珀酸、富馬酸等 TCA 循環(huán)中間產(chǎn)物。
LC-MS/MS：MRM，定量 13C 標(biāo)記代謝物。
五、數(shù)據(jù)分析
代謝流計(jì)算：使用 MetaboAnalyst 5.0 和 SIMCA-P 進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)算 13C 標(biāo)記比例，解析代謝通量變化 (如琥珀酸→富馬酸)。
關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：衣康酸顯著抑制琥珀酸脫氫酶 (SDH) ，導(dǎo)致 13C-琥珀酸堆積； AMs 通過(guò)增強(qiáng)線粒體復(fù)合物 I (ETC-CI) 活性補(bǔ)償能量缺口，進(jìn)而激活炎癥信號(hào)。
Section.03
同位素標(biāo)記物---科研核心工具
在研究人員探索衣康酸是促進(jìn)細(xì)胞炎癥的過(guò)程中，穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)發(fā)揮了不可或缺的貢獻(xiàn)！
精準(zhǔn)解析代謝動(dòng)態(tài)變化
傳統(tǒng)代謝組學(xué)僅能測(cè)定代謝物靜態(tài)濃度，而 13C 穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)可動(dòng)態(tài)追蹤谷氨酰胺 -13C5 在 TCA 循環(huán)中的流向，明確衣康酸抑制 SDH 的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)；通過(guò)計(jì)算 13C 標(biāo)記代謝物的同位素豐度分布，精確評(píng)估代謝通量變化。
區(qū)分內(nèi)源與外源代謝貢獻(xiàn)
通過(guò) 13C 標(biāo)記的琥珀酸與未標(biāo)記物的對(duì)比，排除實(shí)驗(yàn)干擾，確認(rèn)衣康酸直接作用于 SDH ；證實(shí)衣康酸特異性誘導(dǎo) AMs 發(fā)生代謝重編程，而 BMDMs 未出現(xiàn)相同的代謝表型。
揭示細(xì)胞類型特異性調(diào)控機(jī)制
同位素示蹤數(shù)據(jù)表明，AMs 因肺泡微環(huán)境特性 (如低氧、低葡萄糖) 主要依賴氧化磷酸化供能，而 BMDMs 以糖酵解為主；衣康酸通過(guò)抑制 SDH 導(dǎo)致 AMs 中琥珀酸累積，進(jìn)而通過(guò)以下機(jī)制觸發(fā)促炎效應(yīng)：琥珀酸介導(dǎo)的線粒體 ROS 生成增加、激活 HIF-1α 信號(hào)通路及促進(jìn) NLRP3 炎癥小體組裝與活化。這些發(fā)現(xiàn)建立了代謝物動(dòng)態(tài)變化與炎癥反應(yīng)調(diào)控的直接分子關(guān)聯(lián)。
技術(shù)靈敏度高
GC-MS 與 LC-MS/MS 的結(jié)合使用，全面覆蓋 TCA 循環(huán)中關(guān)鍵中間體及其代謝物，檢測(cè)靈敏度高范圍寬。
關(guān)于 MCE
Section.04
小結(jié)
作者采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)，明確解釋了衣康酸并非“萬(wàn)能抗炎分子”，其在肺泡巨噬細(xì)胞中的促炎作用警示臨床開(kāi)發(fā)需謹(jǐn)慎；通過(guò)同位素標(biāo)記技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)認(rèn)知發(fā)起了挑戰(zhàn)，對(duì)靶向治療打開(kāi)了一個(gè)全新思路，如通過(guò)抑制 ETC-CI 或 SDH 活性可能成為緩解肺損傷的一個(gè)治療靶點(diǎn)。未來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)和同位素示蹤方法的不斷進(jìn)步，同位素標(biāo)記技術(shù)將會(huì)能夠更深入、更精細(xì)地解析一些細(xì)胞和組織層面的代謝網(wǎng)絡(luò)，從而為理解疾病的本質(zhì)、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)提供更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
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參考文獻(xiàn)
[1] Shan M, et al., Itaconate promotes inflammatory responses in tissue-resident alveolar macrophages and exacerbates acute lung injury. Cell Metab. 2025 Jun 14:S1550-4131(25) 00268-2.
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