RNA干擾技術(shù)介導基因沉默的原理及其應(yīng)用場景和臨床應(yīng)用
Section.01
RNA 干擾技術(shù)
RNA 干擾是一種通過 RNA 分子介導的基因沉默機制，相較于常規(guī)的抑制劑，RNA 干擾技術(shù)具有無靶點限制、特異性強、生物毒性低等優(yōu)點。常見的應(yīng)用于 RNA 干擾的寡核苷酸有小干擾 RNA (siRNA)、微小 RNA (miRNA) 和反義寡核苷酸 (ASO) 等 (圖 1) ，其基本原理是利用 siRNA、miRNA 或 ASO 與特定的目標基因 mRNA 序列相互作用，從而誘導靶基因的降解或抑制其翻譯，進而實現(xiàn)對特定基因的沉默或抑制。
圖 1. 常見的 RNA 干擾寡核苷酸。Section.02
siRNA、miRNA 和 ASO
如何介導基因沉默？
miRNA、siRNA 屬于雙鏈 RNA，一般包含 20 個左右的核苷酸。短發(fā)夾 RNA (shRNA) 是單鏈 RNA。shRNA 被設(shè)計成能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，當進入細胞后，shRNA 被 Dicer 酶切割成 siRNA。
原理：miRNA、siRN 或 shRNA 進入細胞質(zhì)中，短雙鏈 RNA 解旋后正義鏈被降解。反義鏈與多種蛋白組分形成 RNA 誘導的沉默復(fù)合體 (RNA Induced Silencing Complex, RISC) 。RISC 中保留的反義鏈與靶基因的 mRNA 特異地互補，同時 RISC 具有核酸酶活性，能將靶基因的 mRNA 切割降解，抑制靶基因的表達 (圖 2) 。
值得注意的一點是，如果 siRNA 或者 miRNA 和 mRNA 不完全互補，則 siRNA 或者 miRNA 與靶基因的 3’ 端-非翻譯區(qū)的序列形成非完全互補的雜交雙鏈，miRISC 結(jié)合在雜交雙鏈上，特異性的抑制基因表達。
圖 2. siRNA、miRNA、shRNA、ASO 的作用機制[1]。反義寡核苷酸 (ASOs) 通常指的是短小的、人工合成的單鏈 DNA 或 RNA (13 至 30 個核苷酸)。反義寡核苷酸的作用機制主要包括兩種方式：一是通過空間阻擋，干擾其他分子與靶 RNA 的結(jié)合；二是誘導靶 mRNA 降解。反義寡核苷酸能夠與成熟 mRNA 結(jié)合阻止其附著在核糖體上，阻斷蛋白質(zhì)翻譯或招募 RNase H 引起 mRNA 的降解 (圖 2)。
除了上述這些 RNA 干擾技術(shù)之外，小激活 RNA (saRNA) 作為一種能夠特異性的上調(diào)基因表達的寡核苷酸，也已經(jīng)應(yīng)用于基因功能的研究中。
saRNA：
saRNA，一類非編碼 RNA，結(jié)構(gòu)類似于siRNA，但生物學功能完全相反。siRNA 可以分別與 AGO1、AGO2、AGO3 和 AGO4 四種蛋白結(jié)合以獲得活性，而 saRNA 只能被特異性地加載到 AGO2 蛋白行使功能。
saRNA 的作用機制如下：
1）外源性 saRNA 被加載到細胞質(zhì)中的 AGO2 蛋白上；
2）AGO2 蛋白通過切割和丟棄其中一條 RNA 鏈，形成一個活性的 AGO2-RNA 復(fù)合物，并進入細胞核；
3）AGO2-RNA 復(fù)合物將結(jié)合到基因組 DNA 序列或 DNA 相連的反義轉(zhuǎn)錄本序列，進一步形成 RNA 誘導的轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物；
4）該復(fù)合物與 hnRNPs、RNAPⅡ 和各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，誘導靶基因表達。
SaRNA 作為一種新興的基因調(diào)控技術(shù)，其具有的小分子量、基因特異性，以及激活基因表達的作用特點使其成為正向調(diào)節(jié)基因表達的藥物熱門候選。
Section.03
RNA 干擾技術(shù)的應(yīng)用
miRNA 有哪些應(yīng)用場景？
miRNA 模擬物是與相應(yīng) miRNA 序列互補的合成雙鏈小 RNA 分子，因此在研究中常用于功能性地補充缺失的 miRNA。miRNA inhibitor 具有與要抑制的 miRNA 相互補的序列，并通過與相應(yīng) miRNA 緊密結(jié)合來阻斷其功能。
miRNA agomirs 和 miRNA antagomirs 是 miRNA mimic 和 miRNA inhibitor 的化學修飾版本，該核酸采用特殊化學修飾和末端標記技術(shù)。無需轉(zhuǎn)染試劑即可用于體內(nèi)實驗，通過尾靜脈或局部注射等方法給藥至動物體內(nèi)。
siRNA 有哪些應(yīng)用場景？
關(guān)于 siRNA，往期小 M 為大家詳細介紹過 siRNA 的機制、設(shè)計、體外轉(zhuǎn)染與注意事項等，詳見：干貨分享 | 如何做 RNA 干擾實驗？ (常見問題+解決方案)
對于 siRNA 體內(nèi)實驗而言，由于動物的體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，實驗周期長，對 siRNA 產(chǎn)品的穩(wěn)定性提出了更高的要求。所以一般用于動物實驗的 siRNA 需要做化學修飾。MCE 的預(yù)設(shè)計套裝中的 siRNA 沒有做過化學修飾，所以不適合用于動物實驗。不過我們可以提供不同化學修飾的 siRNA 的定制服務(wù)。除了常規(guī)的化學修飾以外， MCE 也提供包括 GalNAc 偶聯(lián)在內(nèi)的多種偶聯(lián)修飾方法 (圖 3)。
圖 3. 因克西蘭的化學結(jié)構(gòu)：N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶聯(lián)介導的肝靶向遞送。GalNAc 三聚體是典型的修飾方法[2]。ASO 有哪些應(yīng)用場景？
反義寡核苷酸 (ASO) 通過互補與靶標 RNA 結(jié)合，幾乎可影響 RNA 從剪接、轉(zhuǎn)錄到翻譯的各個過程。通常來說，為了增加 ASO 在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性，會采用例如鎖核酸 (LNA) 與硫代磷酸酯 (PS) 修飾等多種類型的化學修飾。
應(yīng)用一：實現(xiàn) mRNA 敲減
ASO 與靶標 mRNA 雜交后可以引發(fā) RNA 酶 H 的作用，并且導致靶標 RNA 的水解，ASO 與靶標 RNA 結(jié)合后也可以通過空間阻礙的方式抑制 mRNA 的翻譯過程。
應(yīng)用二：調(diào)節(jié)前體 mRNA 的剪接
根據(jù) pre-mRNA 序列設(shè)計的 ASO 能夠與目標 pre-mRNA 的外顯子及內(nèi)含子的交界處互補。ASO 與 pre-mRNA 配對形成的雙鏈區(qū)域能夠遏制該位置被識別，引起與 ASO 互補的外顯子在 pre-mRNA 成熟過程中被整段剪切掉。通過這種方式，可以實現(xiàn)對 mRNA 可變剪接功能的研究。
應(yīng)用三：切除 mRNA5' 端帽子結(jié)構(gòu)
如鑭系元素大環(huán)復(fù)合物已被證明可通過親核攻擊三磷酸鍵，特異性地化學切除 5' 端 7'-甲基鳥苷殘基。利用結(jié)合了鑭系元素大環(huán)復(fù)合物的 ASO 可以有效的去除 mRNA5' 端帽子結(jié)構(gòu)。
應(yīng)用四：調(diào)節(jié) mRNA 多聚腺苷酸化位點
真核細胞基因通常被發(fā)現(xiàn)有不止一個多聚腺苷酸化位點。采用 ASO 對前體 mRNA 中的一個多聚腺苷酸化位點進行特異性結(jié)合，使 E 選擇蛋白 (E-selectin) 在加尾時不得不使用上游的多聚腺苷酸化位點，進而達到調(diào)節(jié) mRNA 多聚腺苷酸化位點的目的。
Section.04
RNA 干擾技術(shù)：臨床應(yīng)用
寡核苷酸藥物具有研發(fā)周期短、特異性強、高效性和長效性等明顯性優(yōu)勢，成為近年來全球資本和藥企爭相布局的新賽道。國內(nèi)研究最多的寡核苷酸藥物類型是 siRNA，大部分處于臨床前階段，部分臨床藥物見下表。
表 1. 部分 RNA 臨床在研藥物。
|
產(chǎn)品推薦 |
|
Patisiran sodium 是一種雙鏈小干擾 RNA，靶向 Transthyretin (TTR) 信使 RNA 內(nèi)的序列。 |
|
Inclisiran sodium (HY-132591A) Inclisiran sodium 是一種雙鏈小干擾 RNA (siRNA) 分子，可抑制 PCSK9 的轉(zhuǎn)錄。 |
|
MicroRNA Mimic Negative Control (HY-R04602) MicroRNA Mimic Negative Control 是 21 個核苷酸的 miRNA 模擬物，可作為陰性對照使用。 |
|
Fomivirsen (ISIS-2922) 是一種反義 21 mer 磷酸硫寡核苷酸。 |
|
Nusinersen sodium (HY-112980A) Nusinersen sodium 是一種反義寡核苷酸活性分子，修飾 SMN2 基因的前信使 RNA 剪接。 |
|
Mipomersen sodium (ISIS 301012) 是載脂蛋白 B (apoB) 的反義寡核苷酸抑制劑。 |
|
Inotersen (ISIS-420915) sodium 是一種 2'-O-甲氧基乙基修飾的反義寡核苷酸。 |
|
Givosiran (ALN-AS1) 是一種小干擾 RNA，靶向肝臟氨基纖維素合酶 1 (ALAS1) 信使 RNA。 |
|
Bepirovirsen sodium (HY-147217A) Bepirovirsen sodium 是一種反義寡核苷酸，靶向所有 HBV 信使 RNAs。 |
|
Nusinersen是一種反義寡核苷酸活性分子，修飾 SMN2 基因的前信使 RNA 剪接。 |
[1] Weng Y, et al. RNAi therapeutic and its innovative biotechnological evolution. Biotechnol Adv. 2019 Sep-Oct;37(5):801-825.
[2] Ebenezer O, et al. Development of Novel siRNA Therapeutics: A Review with a Focus on Inclisiran for the Treatment of Hypercholesterolemia. Int J Mol Sci. 2023 Feb 16;24(4):4019.
