小鼠結(jié)腸類(lèi)器官構(gòu)建及誘導(dǎo)的操作流程和步驟

小鼠結(jié)腸炎類(lèi)器官誘導(dǎo)分為兩步：結(jié)腸類(lèi)器官的構(gòu)建及結(jié)腸炎類(lèi)器官的誘導(dǎo)。

結(jié)腸類(lèi)器官的構(gòu)建
一、準(zhǔn)備工作
1、儀器設(shè)備
CO₂ 培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺(tái)、倒置顯微鏡、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、水浴鍋（abs72023）或水浴搖床，醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科鑷。

2、試劑耗材
小鼠正常結(jié)腸類(lèi)器官培養(yǎng)基試劑盒（abs9985）、基質(zhì)膠（低因子、無(wú)酚紅）（abs9495）、60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（abs7005）、 100μm濾篩（abs7009）、15ml離心管（abs7102）、1.5ml EP管若干（abs7119）、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（abs7035）、金屬冰盒、眼科剪刀、眼科鑷。

組分名稱	規(guī)格
小鼠正常結(jié)腸類(lèi)器官培養(yǎng)基 A	100ml
類(lèi)器官原代培養(yǎng)緩沖液 B	250ml
小鼠正常結(jié)腸原代組織消化液 C	30ml
類(lèi)器官傳代消化液 D	30ml
組織保存液 E	100ml
類(lèi)器官凍存液 F	20ml
類(lèi)器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G	250ml

二、操作流程
1、樣本準(zhǔn)備
（1）將組織放入含有預(yù)冷的（2-8°C）組織保存液 E的取樣瓶中（浸沒(méi)整個(gè)組織），4℃從醫(yī)院/實(shí)驗(yàn)室取回。
（2）將取樣瓶消毒，組織取出放入培養(yǎng)皿樣本拍照，并登記，大小，顏色，軟硬程度，組織類(lèi)型等信息。

2、清洗-剪碎
（1）在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（abs7005）里用2-3ml原代培養(yǎng)緩沖液 B浸泡。用原代培養(yǎng)緩沖液 B清洗三次（每次更換培養(yǎng)皿）后剪碎，剪成大約1-3mm³的組織塊，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。

3、消化-過(guò)濾
（2）向15ml離心管中加入5倍原代組織消化液 C（消化液體積：組織體積=5:1，如果估量組織體積困難，使用5mL消化液通常足夠）在4℃進(jìn)行消化15-30min（消化過(guò)程中隨時(shí)觀察消化情況）。

（3）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的細(xì)胞團(tuán)（5-50個(gè)細(xì)胞抱團(tuán)）后， 加入3倍體積原代培養(yǎng)緩沖液 B （緩沖液體積：消化液體積=3:1）終止消化，用槍頭輕柔吹打可以看到液體變渾濁。

 

（4）使用100μm濾篩（abs7009）進(jìn)行過(guò)濾，取少量濾液在鏡下進(jìn)行觀察。將濾液收集到15ml離心管，于300g 4℃ 富集離心5min后移去上清。 

 

4、加膠-點(diǎn)板-加液（這里是整個(gè)原代操作的點(diǎn)睛之筆）
（1）準(zhǔn)備工作
a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過(guò)夜融化
b 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)
c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。

（2）接種要求
24孔板（abs7035），每孔25ul基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物，500-750uL類(lèi)器官培養(yǎng)液

（3）接種密度
密度建議1：基質(zhì)膠體積：細(xì)胞團(tuán)沉淀體積=25:1（如果估摸細(xì)胞團(tuán)沉淀體積困難，通常加300uL基質(zhì)膠足夠）

密度建議2：500個(gè)細(xì)胞團(tuán)/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

（4）加膠-點(diǎn)板
向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠（abs9495），進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液
將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μl類(lèi)器官培養(yǎng)基 A進(jìn)行培養(yǎng)。大概10-14天，多數(shù)類(lèi)器官直徑在200um-500um，可進(jìn)行傳代操作。

鋪板密度

結(jié)腸炎類(lèi)器官的誘導(dǎo)

一、準(zhǔn)備工作
小鼠正常結(jié)腸類(lèi)器官培養(yǎng)基（abs9984）、基質(zhì)膠（低因子、無(wú)酚紅）（abs9495）、DSS（abs9192）、Mouse IL-6 ELISA Kit（abs520004-96T）、Mouse TNF-α ELISA Kit(Advanced)（abs520032-96T）、 60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（abs7005）、100μm濾篩（abs7009）、15ml離心管（abs7102）、1.5ml EP管若干（abs7119）、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（abs7035）、金屬冰盒（abs7289）。

二、結(jié)腸炎類(lèi)器官誘導(dǎo)方法
傳代后的類(lèi)器官，在day2-3，類(lèi)器官雛形出現(xiàn)（囊泡出現(xiàn)），用含有20μg/mL DSS的類(lèi)器官培養(yǎng)基連續(xù)處理120h，期間每2天換一次DSS的類(lèi)器官培養(yǎng)基。

三、結(jié)腸炎類(lèi)器官驗(yàn)證
1、明場(chǎng)驗(yàn)證
每天記錄Control（非炎癥誘導(dǎo)組）和Modle（炎癥誘導(dǎo)組）的類(lèi)器官明場(chǎng)照片。

視頻顯示：與Control相比，Modle類(lèi)器官形態(tài)結(jié)構(gòu)松散，膨大。

明場(chǎng)圖顯示：與Control相比，Modle類(lèi)器官壁明顯增厚。

2、HE染色

H＆E顯示：與Control相比，Model類(lèi)器官壁增厚，上皮排布紊亂，且存在一定程度增生和胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)。

3、類(lèi)器官活死染

活死染顯示：與Control相比，Model類(lèi)器官活性有所減弱。

4、FITC葡聚糖熒光染色

FITC葡聚糖熒光染色：與Control相比，Model類(lèi)器官通透性增強(qiáng)。

5、IL-6和TNF-α檢測(cè)

總結(jié)：通過(guò)對(duì)Control（非炎癥誘導(dǎo)組）和Modle（炎癥誘導(dǎo)組）的指標(biāo)對(duì)比，從明場(chǎng)驗(yàn)證、HE染色、類(lèi)器官活死染、FITC葡聚糖熒光染色、IL-6和TNF-α檢測(cè)等指標(biāo)檢測(cè)，可以驗(yàn)證Modle炎癥誘導(dǎo)成功。

今天講解就到這了，大家如有實(shí)驗(yàn)問(wèn)題，歡迎一起交流哦！

品名	貨號(hào)	規(guī)格
Organotial小鼠正常結(jié)腸類(lèi)器官培養(yǎng)試劑盒	abs9985	1kit
小鼠正常結(jié)腸類(lèi)器官培養(yǎng)基	abs9984	100mL
基質(zhì)膠（低因子、無(wú)酚紅）	abs9495	1.5ml*8
硫酸葡聚糖鈉鹽（DSS）	abs9192	5g
Mouse IL-6 ELISA Kit	abs520004	96T
Mouse TNF-α ELISA Kit	abs520032	96T
2mL低溫金屬冰盒（24孔，平底）	abs7289	1個(gè)
60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿	abs7005	1箱
100μm濾篩	abs7233	1箱
細(xì)胞凍存管	abs7164	1箱
細(xì)胞培養(yǎng)板（標(biāo)準(zhǔn)透明24孔板）	abs7035	1箱
1.5ml EP管若干	abs7119	1箱
15ml離心管	abs7102	1箱
50mL離心管（尖底）	abs7100	1箱
10mL一次性移液管	abs7053	1箱
25mL一次性移液管	abs7054	1箱