轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示祛濕育發(fā)湯治療雄激素性脫發(fā)

英文名：Transcriptomics sequencing reveals Qu-shi-yu-fa Decoction promotes hair cycle and keratinization by upregulating FOXN1 and TGM3 to treat androgenetic alopecia
雜志：Phytomedicine
影響因子：8.3
發(fā)表時(shí)間：2025年5月12日
研究背景：雄激素性脫發(fā)(AGA)影響超過(guò)90%的脫發(fā)患者，且男性更為常見(jiàn)。祛濕育發(fā)湯(QSYF)是一種傳統(tǒng)中藥方劑，在臨床實(shí)踐中對(duì)AGA顯示出積極效果，但其確切治療機(jī)制尚未完全闡明。
研究思路：本研究首先通過(guò)UPLC-MS/MS分析鑒定QSYF的活性成分，建立C57BL/6小鼠的AGA模型評(píng)估QSYF效果，通過(guò)皮膚鏡觀察毛發(fā)生長(zhǎng)情況，組織學(xué)檢查皮膚組織，對(duì)小鼠皮膚樣本進(jìn)行RNA-seq以確定生物過(guò)程和靶點(diǎn)，通過(guò)Western blotting、RT-PCR和免疫熒光測(cè)定評(píng)估RNA-seq分析獲得的生物過(guò)程和靶點(diǎn)，使用靶點(diǎn)抑制劑處理小鼠并觀察毛發(fā)生長(zhǎng)進(jìn)行反向驗(yàn)證，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)確定靶點(diǎn)發(fā)揮作用的關(guān)鍵信號(hào)通路，并通過(guò)Western blotting進(jìn)行驗(yàn)證。

研究結(jié)果：
1、祛濕育發(fā)湯（QSYF）的化學(xué)成分表征
總離子流圖如圖1所示。已鑒定出的成分包括15種黃酮類化合物、6種有機(jī)酸以及其他成分。
 
2、祛濕育發(fā)湯（QSYF）促進(jìn)雄激素性脫發(fā)（AGA）模型小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)
本研究率先探究了QSYF在AGA模型中的治療效果，具體造模流程與給藥方法詳見(jiàn)圖2A。為直觀評(píng)估治療效果，我們?cè)谛∈竺撁�后�?、3、7、10、14、17和21天進(jìn)行拍照（圖2B）。對(duì)小鼠皮膚顏色進(jìn)行量化評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)圖2C。結(jié)果顯示（圖2D），脫毛后第3天起，AGA模型組小鼠的皮膚顏色評(píng)分開(kāi)始低于對(duì)照組，而經(jīng)非那雄胺和QSYF處理后，小鼠皮膚顏色評(píng)分顯著升高。各組小鼠體重?zé)o顯著差異（圖2E）。上述結(jié)果提示，QSYF可促進(jìn)AGA模型小鼠毛發(fā)再生。
 
3、祛濕育發(fā)湯（QSYF）增加皮膚厚度與毛球直徑，改善毛囊周期
小鼠皮膚鏡結(jié)果（圖3A）與整體拍照結(jié)果一致。小鼠皮膚組織蘇木精-伊紅（HE）染色結(jié)果（圖3B）顯示，脫毛后第0天，各組毛球大小和皮膚厚度無(wú)顯著差異，說(shuō)明此階段各組小鼠毛囊處于相同周期階段。脫毛后第7天，對(duì)照組毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期，毛球直徑和皮膚厚度（圖3C、G）顯著大于AGA模型組，而AGA模型組毛囊仍處于休止期。脫毛后第10天和第14天（圖3D、E、H、I）。上述結(jié)果表明，QSYF可增加皮膚厚度和毛球直徑，改善毛囊周期。
 
4、祛濕育發(fā)湯（QSYF）通過(guò)上調(diào)毛囊周期與角化過(guò)程治療雄激素性脫發(fā)（AGA）
為闡明QSYF治療AGA的分子機(jī)制，對(duì)小鼠皮膚組織進(jìn)行了精細(xì)的mRNA測(cè)序（RNA-seq）（圖4A），并通過(guò)熱圖展示AGA模型組與QSYF處理組之間的差異表達(dá)基因（DEGs）（圖4B）。
將這些差異表達(dá)基因用于基因本體論-生物學(xué)過(guò)程（GO-BP）分析，并篩選出與脫發(fā)相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行作圖（圖4C），發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集于角化、毛囊周期、皮膚發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程。為探究QSYF如何調(diào)控這些生物學(xué)過(guò)程，我們進(jìn)行了基因集富集分析（GSEA），結(jié)果顯示QSYF可上調(diào)角化、毛囊周期和皮膚發(fā)育相關(guān)生物學(xué)過(guò)程（圖4D、E、F）；隨后對(duì)其中差異基因?qū)��?yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相互作用分析，并計(jì)算其度值和中期值，為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)。
5、祛濕育發(fā)湯（QSYF）通過(guò)激活WNT信號(hào)通路、增強(qiáng)毛囊活性改善毛囊周期
為探究QSYF作用的詳細(xì)機(jī)制，對(duì)皮膚組織進(jìn)行Ki67染色（圖5A、B）。檢測(cè)了小鼠皮膚組織中與WNT信號(hào)通路相關(guān)的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）結(jié)果（圖5C）顯示，DHT處理后，小鼠皮膚組織中Wnt3a和β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（p<0.05），糖原合成酶激酶-3β（Gsk-3β）的磷酸化水平顯著降低（p<0.05），而非那雄胺和QSYF處理可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象（圖5D、E、F）。β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）的免疫熒光染色結(jié)果（圖5I）與Western blot結(jié)果一致。定量PCR結(jié)果（圖5G、H）也與上述結(jié)果一致，QSYF處理可調(diào)控WNT3A和β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）的轉(zhuǎn)錄水平。上述結(jié)果提示，QSYF可激活WNT信號(hào)通路，促進(jìn)毛囊乳頭細(xì)胞增殖。
6、祛濕育發(fā)湯（QSYF）上調(diào)FOXN1和TGM3的表達(dá)
統(tǒng)計(jì)了6個(gè)檢測(cè)樣本中TGM3和FOXN1的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平（圖6A），結(jié)果顯示，QSYF處理后，F(xiàn)OXN1和TGM3的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高（圖6B、C）。因此，將FOXN1和TGM3選定為QSYF調(diào)控毛囊周期和角化過(guò)程的核心靶點(diǎn)。Western blot和免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)小鼠皮膚組織中FOXN1和TGM3的表達(dá)，結(jié)果一致顯示，QSYF可促進(jìn)AGA模型小鼠皮膚組織中FOXN1和TGM3的表達(dá)（圖6D-I）。QSYF處理可提高小鼠皮膚中FOXN1和TGM3的轉(zhuǎn)錄水平。綜上，我們確定QSYF可在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平上上調(diào)皮膚組織中FOXN1和TGM3的表達(dá)。
7、抑制FOXN1和TGM3加重雄激素性脫發(fā)（AGA）
為明確證實(shí)叉頭框蛋白N1（FOXN1）和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3（TGM3）是祛濕育發(fā)湯（QSYF）發(fā)揮治療作用的核心靶點(diǎn)，分別用生理鹽水、LDN193189（骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號(hào)通路抑制劑，F(xiàn)OXN1是BMP信號(hào)通路下游的轉(zhuǎn)錄因子）、半胱胺（轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑）以及LDN193189與半胱胺的混合物處理雄激素性脫發(fā)（AGA）模型小鼠，實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)給予31.4g/kg劑量的QSYF。
結(jié)果顯示，半胱胺組、LDN193189組以及半胱胺+LDN193189組小鼠的毛發(fā)生長(zhǎng)均受到抑制，毛發(fā)生長(zhǎng)速度慢于31.4g/kgQSYF單獨(dú)處理組，且半胱胺+LDN193189組的毛發(fā)生長(zhǎng)抑制效果最為顯著（圖7A）。皮膚鏡結(jié)果（圖7B）與上述結(jié)果一致。
皮膚顏色評(píng)分結(jié)果顯示（圖7D），脫毛后第10天、14天和17天，31.4g/kgQSYF組小鼠的皮膚顏色評(píng)分高于其余各組；其中，TGM3和FOXN1同時(shí)被抑制的半胱胺+LDN193189組，其皮膚顏色評(píng)分始終最低。
 
蘇木精-伊紅（HE）染色結(jié)果（圖8A）顯示，脫毛后第10天、14天和17天，31.4g/kg QSYF組小鼠的皮膚顏色評(píng)分顯著高于其余各組；且該組小鼠的毛球直徑和皮膚厚度均顯著大于半胱胺+LDN193189組（圖8B-G）。上述結(jié)果表明，QSYF通過(guò)作用于TGM3和FOXN1發(fā)揮治療AGA的作用。
8、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示祛濕育發(fā)湯（QSYF）治療雄激素性脫發(fā)（AGA）的潛在信號(hào)通路
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究祛濕育發(fā)湯（QSYF）的作用機(jī)制。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)與篩選QSYF的可能成分，獲得了97種活性成分對(duì)應(yīng)的264個(gè)作用靶點(diǎn)（圖9A）。之后將藥物靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)與mRNA測(cè)序（RNA-seq）獲得的差異基因進(jìn)行交集分析（圖9B）。借助String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)（圖9C），發(fā)現(xiàn)AKT1、MAPK1等基因的度值較高。對(duì)這53個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（GO）富集分析，結(jié)果顯示它們主要與細(xì)胞群體增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等功能相關(guān)（圖9D）。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，QSYF治療AGA所涉及的信號(hào)通路包括磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路等（圖9E）。上述結(jié)果揭示了QSYF治療AGA的潛在信號(hào)通路。
 
9、祛濕育發(fā)湯（QSYF）激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）信號(hào)通路
多項(xiàng)研究表明，TGM3可通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)通路發(fā)揮治療作用。因此，從邏輯上而言，接下來(lái)探究了TGM3介導(dǎo)的生物學(xué)過(guò)程是否通過(guò)上述信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。
經(jīng)QSYF處理后，AGA模型小鼠背部皮膚中PI3K和AKT的激活水平顯著升高（圖9F、G、H），這表明PI3K-Akt信號(hào)通路被激活；同時(shí)，MEK（絲裂原活化蛋白激酶激酶）和ERK（細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶）的磷酸化水平也顯著升高，這提示MAPK信號(hào)通路被觸發(fā)。上述結(jié)果表明，QSYF可通過(guò)激活PI3K-Akt和MAPK信號(hào)通路，調(diào)控角化過(guò)程；（同時(shí)，QSYF也可通過(guò)相關(guān)）信號(hào)通路調(diào)控毛囊周期與角化過(guò)程。
  總結(jié)：本研究首次證明QSYF通過(guò)上調(diào)FOXN1的表達(dá)調(diào)節(jié)毛周期，并通過(guò)上調(diào)TGM3的表達(dá)促進(jìn)角化，兩者共同發(fā)揮治療AGA的作用。研究不僅為中藥療法的多靶點(diǎn)多通路研究提供了有價(jià)值的見(jiàn)解，也為QSYF治療AGA提供了理論基礎(chǔ)。星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實(shí)驗(yàn)方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對(duì)一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對(duì)畢業(yè)和晉升！