類器官研究發(fā)展歷程、培養(yǎng)指南及其在藥物評估的應用前景

 FDA 宣布將在臨床前安全性研究中減少動物試驗，該方案于 4 月 10 日已開始應用于臨床試驗新藥 (IND) 申請.....

2025 年 4 月 10 日，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）宣布：計劃逐步取消單克隆抗體及其他藥物的動物實驗要求。

不用實驗動物？那用啥呢？

哎嘿，人家給的也很明確：使用包括 AI 計算模型、人類細胞系、類器官以及器官芯片系統(tǒng)等所謂的“新方法論”或 NAMs 數據替代動物實驗。

圖 1. 圖片來源于 FDA 官網新聞公告截圖。

這不，大佬發(fā)言了。



FDA 局長
Martin A. Makary 醫(yī)學博士

“通過利用基于人工智能的計算模型、基于人體器官模型的實驗室測試以及真實世界的人體數據，我們可以更快、更可靠地為患者提供更安全的治療，同時降低研發(fā)成本和藥品價格。這對公共衛(wèi)生和倫理道德而言是雙贏的。”

其實，美國早在2022年9月就正式通過了《FDA現代化法案2.0》《FDA Modernization Act 2.0》，該法案廢除了先前要求新藥在人體臨床試驗前必須進行強制性動物測試的規(guī)定，從而允許在新藥的臨床試驗申請（IND）中使用人工智能模型、類器官芯片等非動物方法作為替代方案。

不過此番 FDA 更加堅定了自己前進的步伐！同時發(fā)布的還有一份《減少臨床前安全性研究中動物實驗的路線圖》，該路線圖概述了FDA通過科學驗證的新方法（NAM）——例如器官芯片系統(tǒng)、計算建模和先進的體外檢測——減少臨床前安全性研究中動物試驗，以及通過多機構聯合 blablabla......具有重要意義。

就在FDA 宣布將逐步取消單克隆抗體和其他藥物的動物試驗要求后，支持與反對的聲音，額.....都有，都有。
 

更重要的是，2022 年 8 月，FDA 批準了全球首個基于“器官芯片”研究獲得臨床前數據的新藥（NCT04658472）進入臨床試驗。

官方認證了啊友友們！

于是，敏銳的各大企業(yè)紛紛開始大力投資和探索人體類器官、器官芯片及 AI 模擬試驗等新模式。MCE 也緊追其上，攜手上海交通大學藥學院簽署戰(zhàn)略合作協(xié)議，圍繞“AI+類器官+藥物研發(fā)”開展深度合作，共建國家級智能類器官藥物研發(fā)戰(zhàn)略平臺。

Section.01
人體“類器官”

人體“類器官”
類器官的首次提出：1997年。

但直到 2009 年，才出現第一個“完全”意義上的類器官模型——由荷蘭癌癥中心 (NKI) 的 Hans Clevers 團隊培育的人造腸類器官 (Intestinal Organoid)，類器官研究取得重大突破。再到 2011 年，該團隊又進一步成功地利用結直腸癌患者的腫瘤組織構建了結直腸癌類器官模型，首次將類器官模型拓展至腫瘤學研究領域，目前患者來源的類器官 (Patient-derived organoid，PDO) 模型在腫瘤領域研究十分火熱。在 2019 年，類器官登上了全球頂級學術期刊 Science 的封面，被評選為年度重大突破 (圖 2)^[1]

圖 2. 類器官研究的發(fā)展歷程^[1]。

類器官是模擬天然組織結構和功能的自組織細胞培養(yǎng)物（例如肝臟類器官、腸道類器官），可以由成體組織中的干細胞或多能干細胞生成。作為傳統(tǒng)二維培養(yǎng)和動物模型之間的橋梁，具有諸多優(yōu)勢，既能提供實驗可操作性，又能捕捉生物的復雜性 (如下表 所示)^[2]。

類器官培養(yǎng)與二維細胞培養(yǎng)及動物研究的比較^[2]。

通常來講，人類類器官可從正�；驉盒栽�代組織中生成，最常用的方法是 R-spondin 方法，該方法是生成小腸類器官的基本設計原則�；蛘撸�體細胞可以重編程為誘導多能干細胞，通過定向分化，可用作所有三個胚層的類器官來源^[2]。

目前，類器官技術已與基因組編輯、單細胞基因組學、活體成像和微流體技術等技術良好地融合，應用于疾病建模、篩選抗癌藥物、識別藥物毒性、基因測試和細胞療法等諸多領域。不僅為發(fā)育過程和疾病發(fā)病機制提供了新的見解，也加速了疾病診斷和治療方法的研究進程。

關于類器官的模型構建小 M 在往期推文已進行過實操案例的解讀，此處不在贅述。但是！類器官的實操也要多多留心，科研人表示：翻車的代價，莫要挨邊！

類器官培養(yǎng)指南
樣本：選擇、保存、清洗^[3][4]

• 組織來源：新鮮樣本 (手術或活檢)＞凍存組織，但若必須凍存，記得使用凍存液 (別讓細胞變成“冰棍”)。
• 運輸介質：用專用的試劑保存組織細胞的活性，避免樣本在運輸途中壞死。
• 保存時間：4℃ 保存不超過 24 h，-80℃ 或液氮長期保存 (但復蘇后活性可能打折扣)。
• 培養(yǎng)基/PBS 沖洗：去除血液、粘液和碎片，否則消化時會“一鍋糊”，建議冰上操作。
• 抗生素防污染：對于污染風險比較高的樣本 (如腸道、腫瘤組織)，可加 1% P/S 殺菌。

 
組織消化

• 預處理：清洗干凈的樣本剪切成合適的大小準備消化。
• 酶選擇：膠原酶 IV (溫和)、胰蛋白酶 (較強) 以及商品化的消化液都可以使用！ 
• 注意觀察：每 5 min 觀察一次組織的消化情況，避免消化過頭。
• 終止消化：使用無血清終止液，避免 FBS 未知成分干擾。

 
接種培養(yǎng)、傳代、凍存、復蘇

• 基質膠：提前解凍，冰上操作 (室溫凝固)。
• 培養(yǎng)：選擇合理細胞密度 (可參考文獻進行優(yōu)化) 培養(yǎng)，專用培養(yǎng)基提供生長、分化物質,類器官長滿或成熟后,進行分離、消化、傳代——輕柔吹打或短暫消化傳代。
• 凍存：傳代 2~3 次的類器官活力佳，凍存密度＞ 2×10⁵/mL。
• 復蘇要快：37℃ 水浴快速融化，慢吞吞？細胞會“凍傷”。

 
類器官檢測

• 細胞活性：在藥敏實驗中經常會用到 3D&類器官 ATP 和活力檢測試劑來進行基礎活性判斷。
• 染色：DAPI 染核，標志物特異性識別，多維度表型鑒定。MCE 最新開學季活3D 細胞培養(yǎng)類，專享 65 折！

Section.02 
器官芯片系統(tǒng)

器官芯片系統(tǒng)

言歸正傳！NCT04658472 是首個使用微生理系統(tǒng) (MPS，通過微流控技術實現多器官聯動) 數據提交的 IND，星星之火可以燎原，器官芯片賽道被“唰唰唰”點燃！

器官芯片(Organs-on-a-Chips，OOC) 是生物工程的小型化系統(tǒng)，內有在微流體芯片內生長的細胞/組織^[5]。從命名上就能看出其涉及多學科領域，生物學，材料學，工程學，blabla~~

其得益于微流體和各種設備 (例如微型顯微鏡、無透鏡顯微鏡) 和監(jiān)測系統(tǒng)，例如執(zhí)行器、傳感器和生物傳感器 (用于實時監(jiān)測細胞生長和活力以及維持健康和最佳的培養(yǎng)微環(huán)境) 的發(fā)展^[5]。

通常，OOC 由三個主要組成部分組成：(1) 模擬細胞可以附著、生長和相互作用的器官組織的微通道，(2) 在通道 (或孔) 中培養(yǎng)的活細胞，例如干細胞，以及 (3) 仿生環(huán)境，維持與器官相關的條件，例如營養(yǎng)物質、氧氣水平和液體流動^[5]。

各位友友們可以通過下圖簡單了解下~

圖 3. 無支架骨髓芯片橫截面示意圖的放大 3D 圖^[5]。
包括用于顯微鏡實時觀察的玻璃層和容納上部細胞培養(yǎng)微室的三個 PDMS 層，與下部培養(yǎng)基灌注分離，中間多孔膜。

相比類器官，器官芯片裝置則更進一步，在生物工程芯片上整合了微流體、機械力和多細胞共培養(yǎng)，模擬體內環(huán)境。例如，人體肝臟芯片可以在灌注條件下將肝細胞與非實質細胞共培養(yǎng)，表現出類似肝臟的代謝和反應。這些平臺保留了動物所缺乏的人類特異性生物學特性，從而能夠檢測僅在人體組織中表現出來的效應。

當然，OOC 的設計多種多樣。研究人員和工程師已經設計和制造了具有精確結構和專用微流體通道的微流體裝置。設計的選擇取決于支持細胞/組織生長和功能的培養(yǎng)需求。通常還會集成微泵和微閥等控制系統(tǒng)，用于控制通道內的壓力和流體流動^[5]。

OOC 技術的優(yōu)點^[5]

01
OOC 技術減少并最終避免了動物試驗。平臺可以為人體模型重新創(chuàng)建高度可重復的環(huán)境，無需進行動物試驗。它們可實現高通量篩選和測試，降低任務成本和時間，同時提高效率。

02
OOC 可用于個性化測試。現在可以通過將人自己的細胞集成到 OOC 設備中來重新創(chuàng)建微環(huán)境。這樣可以實時監(jiān)測各種藥物的反應、有效性及其毒性，以及檢測各種生物標志物。 

03
OOC 也可用于醫(yī)學測試。由于 OOC 平臺體積小且自動化，因此可用于床旁診斷，例如在醫(yī)院或移動診所，從而實現分散測試。

04
OOC 可以在同一芯片上集成多種檢測，并且可以同時執(zhí)行各種并行測試，而無需依賴復雜的儀器 (并行測試)。

05
此外，OOC 還可用于藥物遞送和毒性測試。各種人類疾病都可以在 OOC 和靶向藥物遞送系統(tǒng)上建模，可以通過使用各種運輸機制 (例如納米顆粒) 進行評估，并在評估藥物的療效和毒性的同時重建類人細胞和生理屏障。

目前已有各種器官芯片技術，如：Brain-on-a-chip、Bone-on-a-chip、Kidney-on-a-chip、Lung-on-a-chip、Pancreas-on-a-chip、Heart-on-a-chip、Stomach-on-a-chip 等，以及開發(fā)的人體芯片 (Human-on-a-chip) ——涉及創(chuàng)建可刺激人體器官功能的微流體裝置^[5]。

人體芯片 (Human-on-a-chip)

人體芯片裝置的開發(fā)技術就比較復雜，其涉及將多器官(2 至 10 個器官) 整合到芯片上。例如，它需要復雜的微流體通道、龐大的裝置和精密的處理系統(tǒng) (如果實現自動化)。當然，它們需要在多個腔室中培養(yǎng)可能來自不同器官的不同細胞類型，這些腔室通過循環(huán)培養(yǎng)基連接，以模擬血液循環(huán)系統(tǒng)并研究多器官的生理學^[4]。其不僅可以預測藥物對目標器官的影響，還可以使用芯片體系統(tǒng)，深入了解藥物遞送對其他器官的副作用。

還記得前面提過的 NCT04658472 臨床試驗么？其前期的部分支持數據就來自于人體芯片模型。

2022 年 4 月，John W Rumsey 等人在 Advanced Therapeutics 期刊發(fā)布題為“Classical Complement Pathway Inhibition in a “Human-On-A-Chip” Model of Autoimmune Demyelinating Neuropathies”的文獻^[6]。

圖 4. 一種新型體外人體芯片系統(tǒng)^[6]。
該系統(tǒng)由人誘導多能干細胞 (iPSC) 衍生的運動神經元和人施萬細胞組成，這些細胞在微電極陣列 (MEA) 上培養(yǎng)，微電極陣列上裝有通道，用于引導軸突生長到電極上。作者用抗 GM1 多克隆 IgG 和純化的人補體蛋白處理該系統(tǒng)，以建立并表征 EAN 的首個 HoaC 疾病模型。隨后，用 MMN 和 CIDP 患者的血清處理該 HoaC 系統(tǒng)，建立了兩種罕見的外周脫髓鞘神經病模型。最后，用 TNT005 (一種抑制經典補體途徑關鍵蛋白酶 C1s 的鼠單克隆抗體 (mAb)）處理 MMN 和 CIDP 系統(tǒng)，以挽救疾病效應。

研究首次構建了用于研究獲得性炎性脫髓鞘性神經病的運動神經元傳導速度的罕見疾病——慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經病 (CIDP) 和多灶性運動神經病 (MMN)——的表型人體芯片 (HoaC) 電傳導模型。HoaC 模型使用微電極陣列，在用患者血清處理的電極上定向軸突生長，結果顯示運動神經元動作電位頻率和傳導速度降低，TNT005 處理后挽救了血清誘導的補體沉積和功能缺陷^[6]。

該模型生成的數據為 NCT04658472 的臨床前試驗中測試 C1s 抑制效果提供了支持，并通過 FDA 批準，進入臨床試驗。

Section.03
先進的計算機模擬

FDA 新發(fā)布的路線圖鼓勵開發(fā)者利用計算機建模和人工智能 (AI) 來預測藥物的行為^[7]。主要的計算機模擬工具包括：

• 基于生理學的藥代動力學 (PBPK) 建模：PBPK 模型是利用物種特異性生理學對藥物 ADME (吸收、分布、代謝、排泄) 進行數學模擬。
• 機器學習和人工智能預測模型：機器學習算法可以根據藥物序列特征、結構基序和已知的臨床結果進行訓練。目前開發(fā)的機器學習模型可以分析抗體可變區(qū)的氨基酸序列，以預測單克隆抗體可能具有高還是低的免疫原性。
• 定量系統(tǒng)藥理學(QSP) 和生物通路建模：QSP 模型結合了計算生物學和藥理學，模擬藥物如何與復雜的人體生物網絡相互作用。例如，自身免疫性疾病的 QSP 模型可以模擬抗體如何調節(jié)炎癥通路，從而有助于預測有效劑量范圍和潛在的毒性后果 (例如免疫系統(tǒng)過度抑制)。這些模型可以通過提供一個虛擬人體來測試“假設”情景，從而減少對動物疾病模型的依賴。
• 生物信息學和計算機模擬脫靶篩選：利用人類蛋白質數據庫和人工智能，可以篩選產品序列中是否存在任何非預期靶點(例如與人體組織的交叉反應)。計算機模擬工具可以分析藥物是否可能與人體蛋白質組中的相似表位結合，從而突出潛在的安全隱患，而這些隱患傳統(tǒng)上需要通過動物組織交叉反應研究或廣泛的受體結合組來檢查。

 
總體而言，計算機模擬自然醫(yī)學模型 (NAM) 可以通過數據和建模預測與人類相關的結果，從而成為動物研究的有力補充或替代。

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[1] XIAO Yi, et al. Research progress and future perspectives of tumor organoid[J]. China Oncology, 2024, 34(8): 763-776 
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[7] Roadmap to Reducing Animal Testing in Preclinical Safety Studies.