STING固有免疫蛋白的信號通路、翻譯后修飾功能及WB檢測技巧
作為固有免疫信號通路的關鍵蛋白，STING廣泛表達于多種組織。STING的免疫調(diào)節(jié)作用使其成為腫瘤免疫治療領域的明星靶點，已在免疫學和病理學領域的研究取得了重要進展。
大家在檢測STING蛋白時是不是也會得到與預期不符的結果呢？本篇文章總結了一些要點和大家一起探討，請和小優(yōu)細節(jié)君一起學習吧~
STING
干擾素基因刺激物(Stimulator of Interferon Genes，STING)通過與細胞內(nèi)DNA結合，并在胞內(nèi)形成二聚體，從而激活下游信號通路，引發(fā)免疫細胞產(chǎn)生干擾素和其他免疫調(diào)節(jié)分子，以應對病毒感染和其他病理狀態(tài)。
STING蛋白主要以對稱二聚體形式存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。下圖以人 STING(hSTING) 蛋白為例，全長由C末端結構域(CTD)和跨膜結構域(TM)組成。CTD由配體結合域(LBD)或C末端尾部(CBD)和C末端尾部(CTT)組成，通常負責結合、蛋白質(zhì)相互作用和信號轉導。TM結構域，也稱為N-末端區(qū)域，它在物種間是保守的，具有重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜支持作用。
cGAS-STING信號通路
cGAS-STING信號通路是一種經(jīng)典且重要的機體免疫應答途徑。
cGAS（Cyclic GMP-AMP Synthase）是一種DNA感應的酶，它與來自死細胞、病毒和細菌的DNA相互作用，在ATP和GTP存在的情況下催化合成二聚體的cGAMP（cyclic GMP-AMP），后者和細菌來源的環(huán)二核苷酸（CDNs）都可誘導STING的激活。
STING被激活后，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉移到高爾基體，在高爾基體區(qū)激活了TBK1和IKK，分別使IRF3和IκBα（NF-κB的抑制物）磷酸化。然后IRF3和IκBα二聚體進入細胞核，觸發(fā)了促炎癥細胞因子的轉錄和翻譯，如I型IFN、TNF和IL6，這些細胞因子可以參與抗病毒免疫應答和自身免疫調(diào)控。
以上介紹了這么多STING，怎么樣才能在WB檢測中獲得理想的條帶呢？
01 確認好的研究對象
雖然STING廣泛表達于多種組織類型，包括免疫細胞和非免疫細胞來源，但不代表每種細胞/組織都能檢測到STING的表達。因此，在選擇某種特定樣本進行探究實驗時，最好先查閱文獻和數(shù)據(jù)庫看看是否有足夠的表達量，也可以同時使用表達量高的細胞樣本或者組織作為陽性對照來進行實驗。THP-1細胞是經(jīng)典的cGAS-STING信號通路的工具細胞。
02 制樣時要超聲
如果樣本中STING的表達量不高，裂解細胞/組織時加以超聲，有助于斷裂染色質(zhì)，同時增加蛋白的可溶性，使抗原表位充分暴露出來，與抗體結合更容易。
超聲的方法也比較簡單，細胞或組織裂解后，置于冰上，超聲條件是10-15s，3 次(期間每次間隔10s)，超聲頻率是30%－40%，電流30A; 如果沒有超聲儀，可以采用1ml 帶針頭的注射器冰上反復抽吸10-15 次替代，直到裂解液澄清好吸為止。
03 磷酸化檢測
外來核酸（如病毒DNA或細菌DNA）是STING信號通路激活的常見來源之一。當然，細胞發(fā)生自發(fā)性的DNA損傷或某些細胞內(nèi)代謝異常時，也會導致細胞內(nèi)DNA的釋放，從而激活STING。
在研究過程中應該采用適當?shù)奶幚項l件，如使用合適的激活劑（如cGAMP和DNA）以激活STING蛋白。此外，細胞的處理時間和劑量也需要進行優(yōu)化，以確保適當?shù)牧姿峄健?br />
要知道STING信號通路的蛋白表達情況在不同的細胞系中差距非常大，同樣的刺激方法在某些細胞中可以得到陽性結果，換一個細胞系可能就不可行了。文獻中比較常見的工具細胞是RAW264.7細胞和小鼠骨髓源性的巨噬細胞。
CST推薦使用5 μg/mL poly(dA:dT)轉染3小時的條件處理細胞以獲得磷酸化STING的對照樣品。下圖為CST科學家使用同樣的刺激方法對不同表達STING的細胞系進行刺激，然后檢測磷酸化STING的結果�？梢钥吹郊词雇瑯邮荢TING高表達的細胞，在poly(dA:dT)刺激下，STING的磷酸化水平也是不一樣的。
還有一點很容易被大家忽略：STING在磷酸化之后會出現(xiàn)條帶分子量上調(diào)的情況。在轉膜時就需要將膜留的寬一些，避免目的信號被裁去。
STING磷酸化上下游通路涉及到TBK1、IRF3、NF-κB等多個信號分子，相關靶標的結果 也可以作為STING磷酸化表達的參考依據(jù)。
04 其他翻譯后修飾
除磷酸化外，STING還存在多種類型的翻譯后修飾，包括多泛素化、SUMO化、棕櫚�；⑾趸榛�、氧化、羰基化和二硫鍵形成。這些修飾對STING的活化發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，如K48-多聚泛素化主要促進STING經(jīng)蛋白酶體途徑的降解；K63-多聚泛素化可以促進STING活化復合體的形成等。
下表詳細展示了STING翻譯后修飾的功能，大家在選擇研究方向和檢測位點時都可以參考~
以上是小優(yōu)細節(jié)君總結的一些關于STING的WB檢測Tips，當您一直重復實驗得不到理想結果時可以根據(jù)上述建議進行調(diào)整嘗試，可能一個小細節(jié)的改變就可以幫您得到理想的實驗結果。
以下部分推薦產(chǎn)品助力您的實驗：
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參考文獻：
1.Chen, Qi et al. “Regulation and function of the cGAS-STING pathway of cytosolic DNA sensing.” Nature immunology vol. 17,10 (2016): 1142-9. doi:10.1038/ni.3558
2.Decout, Alexiane et al. “The cGAS-STING pathway as a therapeutic target in inflammatory diseases.” Nature reviews. Immunology vol. 21,9 (2021): 548-569. doi:10.1038/s41577-021-00524-z
3.Zhang, Zili et al. “Multifaceted functions of STING in human health and disease: from molecular mechanism to targeted strategy.” Signal transduction and targeted therapy vol. 7,1 394. 23 Dec. 2022, doi:10.1038/s41392-022-01252-z
4.https://www.proteinatlas.org/ENSG00000184584-STING1
