PI3K之P85蛋白的WB檢測結果常見問題及解決方法
說起磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks），大家都不陌生，大量研究表明其是癌癥、血栓形成、炎癥及免疫性疾病的重要治療靶點[1]。尤其是p85/p-p85蛋白，更是多種通路研究繞不開的熱點。然而科研的成功不會像山坡上的蒲公英那樣唾手可得，在進行WB檢測p85/p-p85時，時常會遇到一些棘手的問題讓人苦惱不已。今天小優(yōu)細節(jié)君就來和大家聊一聊p85/p-p85檢測的二三事。
PI3Ks是一個脂質激酶家族，可以通過磷酸化細胞內肌醇脂質來調節(jié)信號傳導和細胞內小泡運輸。哺乳動物有八種PI3K亞型，分為三類。I類PI3Ks產生3-磷酸肌醇脂質，其直接激活信號轉導途徑。除了在癌癥中經常被基因激活外，在人類非惡性過度生長綜合征和易患淋巴瘤的原發(fā)性免疫疾病中也發(fā)現(xiàn)了I類PI3K的類似突變。II類和III類PI3K是內吞途徑、內體循環(huán)和自噬中膜交通的調節(jié)因子，通常對細胞信號傳導具有間接影響[2]。目前I類PI3Ks的研究最為廣泛。
I類PI3K是p110催化亞基與調控亞基復合的異二聚體，根據調節(jié)亞基的差異，I類PI3K被細分為IA類和IB類酶。其中IA類酶包括催化亞基（p110α、p110β和p110δ）與p85調節(jié)亞基，哺乳動物有三個編碼p85亞基的基因：PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3，其中，PIK3R1編碼p85α、p55α、p50α，這是由于可變剪切造成的，PIK3R2和PIK3R3則分別編碼p85β和p55γ。這些亞型中，p85α和p85β多肽在大多數細胞中表達，而其他亞型的表達則有限[3]。
IA類PI3K催化亞基與調節(jié)亞基復合形成的p85–p110異二聚體在胞質中保持無活性的狀態(tài)。通過p85的SH2結構域與酪氨酸磷酸化蛋白（如受體酪氨酸激酶）或其他膜結合蛋白（如胰島素受體底物蛋白）的結合，被募集到質膜。這種募集可以使p85–p110二聚體去抑制，并與胞膜中的脂質底物結合。一項研究通過質譜方法和具有內源性標記IA類亞基的小鼠模型進行實驗表明，p85α和p85β與p110α和p110β等效結合，而p85α優(yōu)先與p110δ相互作用。同時，該研究還為存在不與p110結合的獨立p85亞基提供了證據[4]。一些研究還表明p55蛋白與成纖維細胞內鈣釋放相關[5]，還可參與細胞周期調節(jié)[6]，并且一些給藥處理可能使其與p85表現(xiàn)相反的表達趨勢[7]。
經過前面的介紹，相信大家已經對p85/p-p85蛋白的相關信息和研究有了進一步的了解，在此基礎上，我們也一起來看看，關于WB實驗中p85/p-p85蛋白檢測時可能會遇到的一些問題和排查的方法。
在我們檢測p85/p-p85條帶時，常會遇到這樣的結果，得到的條帶中既有85KD的蛋白條帶，也有55KD附近的條帶。根據前文我們可以知道，這很可能是由于可變剪切造成的，我們可以先查閱文獻及數據庫如uniprot等，輔助判斷一下樣本中是否可能存在50KD附近的isoform。如果是檢測p-p85，可以結合p85的結果綜合判斷，如兩組檢測結果均存在50KD附近的條帶，可以認為是可變剪切的蛋白條帶。如果想要進一步確定條帶的特異性，還可以通過更換樣本以及設計敲除實驗進行驗證。
除去上述檢測到多條帶的情況，還有時會出現(xiàn)僅檢測到55KD條帶的情況，多發(fā)生在p-p85蛋白的檢測中，這種情況下首先可以嘗試遮擋50KD處進行曝光，看下85KD處是否可以顯出條帶，避免因50KD處信號條帶過強，顯影時掩蓋了85KD處的信號；其次，在下圖中，我們可以看到，檢測p85時，85KD和50KD附近均有清晰且明顯的條帶，推測50KD附近條帶時可變剪切體的磷酸化條帶。這時，還可以使用去磷酸化的堿性磷酸酶對轉印后的膜進行處理，或使用λ磷酸酶處理樣本再進行檢測，看下50KD處條帶是否依然存在，如處理后條帶消失，說明其是磷酸化的剪切體。另外，這種情況也可以通過更換樣本進行檢測輔助判斷。
在常見的多條帶和條帶位置與預期不符以外，還可能會出現(xiàn)無條帶的情況，這時我們可以先查詢文獻及數據庫，如HPA、BioGPS等初步判斷一下p85在樣本中的表達水平如何。如樣本中靶標蛋白的表達量偏低，可以在提取蛋白時進行超聲處理，提高蛋白提取效率，并適當提高蛋白上樣量。也可以使用一些高表達的樣本同時進行WB檢測，排查是否是樣本原因導致了無信號的結果，還可以更換免疫位點不同的抗體進行實驗，排查無信號的具體原因，從而解決問題。
另外由于p85蛋白存在可變剪切體的形式，在初次進行實驗時，建議保留完整的膜進行檢測，先確定樣本中目的蛋白的具體分子量，避免因裁膜范圍不當，導致目的蛋白丟失，影響實驗結果。
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[2] Bilanges B, Posor Y, Vanhaesebroeck B. PI3K isoforms in cell signalling and vesicle trafficking. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Sep;20(9):515-534. doi: 10.1038/s41580-019-0129-z. PMID: 31110302.
[3] Amzel LM, Huang CH, Mandelker D, Lengauer C, Gabelli SB, Vogelstein B. Structural comparisons of class I phosphoinositide 3-kinases. Nat Rev Cancer. 2008 Sep;8(9):665-9. doi: 10.1038/nrc2443. PMID: 18633356; PMCID: PMC2847604.
[4] Tsolakos, N. et al. Quantitation of class IA PI3Ks in mice reveals p110-free-p85s and isoform- selective subunit associations and recruitment to receptors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, 12176–12181 (2018)
[5] Farrar CS, Hocking DC. Assembly of fibronectin fibrils selectively attenuates platelet-derived growth factor-induced intracellular calcium release in fibroblasts. J Biol Chem. 2018 Nov 30;293(48):18655-18666. doi: 10.1074/jbc.RA118.004020. Epub 2018 Oct 15. PMID: 30323067; PMCID: PMC6290149.
[6] Xia C, He Z, Cai Y, Liang S. Vorinostat upregulates MICA via the PI3K/Akt pathway to enhance the ability of natural killer cells to kill tumor cells. Eur J Pharmacol. 2020 May 15;875:173057. doi: 10.1016/j.ejphar.2020.173057. Epub 2020 Mar 2. PMID: 32135122.
[7] He B, Guo W, Shi R, Hoffman RD, Luo Q, Hu YJ, Gao J. Ruyong formula improves thymus function of CUMS-stimulated breast cancer mice. J Ethnopharmacol. 2023 Sep 16;319(Pt 1):117164. doi: 10.1016/j.jep.2023.117164. Epub ahead of print. PMID: 37717843.
PI3Ks是一個脂質激酶家族，可以通過磷酸化細胞內肌醇脂質來調節(jié)信號傳導和細胞內小泡運輸。哺乳動物有八種PI3K亞型，分為三類。I類PI3Ks產生3-磷酸肌醇脂質，其直接激活信號轉導途徑。除了在癌癥中經常被基因激活外，在人類非惡性過度生長綜合征和易患淋巴瘤的原發(fā)性免疫疾病中也發(fā)現(xiàn)了I類PI3K的類似突變。II類和III類PI3K是內吞途徑、內體循環(huán)和自噬中膜交通的調節(jié)因子，通常對細胞信號傳導具有間接影響[2]。目前I類PI3Ks的研究最為廣泛。
I類PI3K是p110催化亞基與調控亞基復合的異二聚體，根據調節(jié)亞基的差異，I類PI3K被細分為IA類和IB類酶。其中IA類酶包括催化亞基（p110α、p110β和p110δ）與p85調節(jié)亞基，哺乳動物有三個編碼p85亞基的基因：PIK3R1、PIK3R2和PIK3R3，其中，PIK3R1編碼p85α、p55α、p50α，這是由于可變剪切造成的，PIK3R2和PIK3R3則分別編碼p85β和p55γ。這些亞型中，p85α和p85β多肽在大多數細胞中表達，而其他亞型的表達則有限[3]。
Fig.1 I類PI3K的IA類結構示意圖
IA類PI3K催化亞基與調節(jié)亞基復合形成的p85–p110異二聚體在胞質中保持無活性的狀態(tài)。通過p85的SH2結構域與酪氨酸磷酸化蛋白（如受體酪氨酸激酶）或其他膜結合蛋白（如胰島素受體底物蛋白）的結合，被募集到質膜。這種募集可以使p85–p110二聚體去抑制，并與胞膜中的脂質底物結合。一項研究通過質譜方法和具有內源性標記IA類亞基的小鼠模型進行實驗表明，p85α和p85β與p110α和p110β等效結合，而p85α優(yōu)先與p110δ相互作用。同時，該研究還為存在不與p110結合的獨立p85亞基提供了證據[4]。一些研究還表明p55蛋白與成纖維細胞內鈣釋放相關[5]，還可參與細胞周期調節(jié)[6]，并且一些給藥處理可能使其與p85表現(xiàn)相反的表達趨勢[7]。
經過前面的介紹，相信大家已經對p85/p-p85蛋白的相關信息和研究有了進一步的了解，在此基礎上，我們也一起來看看，關于WB實驗中p85/p-p85蛋白檢測時可能會遇到的一些問題和排查的方法。
在我們檢測p85/p-p85條帶時，常會遇到這樣的結果，得到的條帶中既有85KD的蛋白條帶，也有55KD附近的條帶。根據前文我們可以知道，這很可能是由于可變剪切造成的，我們可以先查閱文獻及數據庫如uniprot等，輔助判斷一下樣本中是否可能存在50KD附近的isoform。如果是檢測p-p85，可以結合p85的結果綜合判斷，如兩組檢測結果均存在50KD附近的條帶，可以認為是可變剪切的蛋白條帶。如果想要進一步確定條帶的特異性，還可以通過更換樣本以及設計敲除實驗進行驗證。
除去上述檢測到多條帶的情況，還有時會出現(xiàn)僅檢測到55KD條帶的情況，多發(fā)生在p-p85蛋白的檢測中，這種情況下首先可以嘗試遮擋50KD處進行曝光，看下85KD處是否可以顯出條帶，避免因50KD處信號條帶過強，顯影時掩蓋了85KD處的信號；其次，在下圖中，我們可以看到，檢測p85時，85KD和50KD附近均有清晰且明顯的條帶，推測50KD附近條帶時可變剪切體的磷酸化條帶。這時，還可以使用去磷酸化的堿性磷酸酶對轉印后的膜進行處理，或使用λ磷酸酶處理樣本再進行檢測，看下50KD處條帶是否依然存在，如處理后條帶消失，說明其是磷酸化的剪切體。另外，這種情況也可以通過更換樣本進行檢測輔助判斷。
在常見的多條帶和條帶位置與預期不符以外，還可能會出現(xiàn)無條帶的情況，這時我們可以先查詢文獻及數據庫，如HPA、BioGPS等初步判斷一下p85在樣本中的表達水平如何。如樣本中靶標蛋白的表達量偏低，可以在提取蛋白時進行超聲處理，提高蛋白提取效率，并適當提高蛋白上樣量。也可以使用一些高表達的樣本同時進行WB檢測，排查是否是樣本原因導致了無信號的結果，還可以更換免疫位點不同的抗體進行實驗，排查無信號的具體原因，從而解決問題。
另外由于p85蛋白存在可變剪切體的形式，在初次進行實驗時，建議保留完整的膜進行檢測，先確定樣本中目的蛋白的具體分子量，避免因裁膜范圍不當，導致目的蛋白丟失，影響實驗結果。
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產品貨號 |
產品名稱 |
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PI3 Kinase p85 Antibody |
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PI3 Kinase p85(19H8) Rabbit mAb |
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Phospho-PI3 Kinase p85 (Tyr458)p55 (Tyr199) Antibody |
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Phospho-PI3 Kinase p85 (Tyr458)p55 (Tyr199)(E3U1H) Rabbit mAb |
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PI3 Kinase p55 (D2B3) Rabbit mAb |
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Rabbit anti-PI3 Kinase p85 Monoclonal Antibody |
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Rabbit anti-PI3 Kinase p85 Recombinant Monoclonal Antibody(R108) |
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Rabbit anti-Phospho-PI3-kinase p85-α(Tyr607) Polyclonal Antibody |
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Rabbit anti-PI3K p85 α(pY467/199) Polyclonal Antibody |
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Mouse anti-PI 3 Kinase p85α Monoclonal Antibody |
參考文獻：
[1] Miller MS, Thompson PE, Gabelli SB. Structural Determinants of Isoform Selectivity in PI3K Inhibitors. Biomolecules. 2019 Feb 26;9(3):82. doi: 10.3390/biom9030082. PMID: 30813656; PMCID: PMC6468644.[2] Bilanges B, Posor Y, Vanhaesebroeck B. PI3K isoforms in cell signalling and vesicle trafficking. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Sep;20(9):515-534. doi: 10.1038/s41580-019-0129-z. PMID: 31110302.
[3] Amzel LM, Huang CH, Mandelker D, Lengauer C, Gabelli SB, Vogelstein B. Structural comparisons of class I phosphoinositide 3-kinases. Nat Rev Cancer. 2008 Sep;8(9):665-9. doi: 10.1038/nrc2443. PMID: 18633356; PMCID: PMC2847604.
[4] Tsolakos, N. et al. Quantitation of class IA PI3Ks in mice reveals p110-free-p85s and isoform- selective subunit associations and recruitment to receptors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, 12176–12181 (2018)
[5] Farrar CS, Hocking DC. Assembly of fibronectin fibrils selectively attenuates platelet-derived growth factor-induced intracellular calcium release in fibroblasts. J Biol Chem. 2018 Nov 30;293(48):18655-18666. doi: 10.1074/jbc.RA118.004020. Epub 2018 Oct 15. PMID: 30323067; PMCID: PMC6290149.
[6] Xia C, He Z, Cai Y, Liang S. Vorinostat upregulates MICA via the PI3K/Akt pathway to enhance the ability of natural killer cells to kill tumor cells. Eur J Pharmacol. 2020 May 15;875:173057. doi: 10.1016/j.ejphar.2020.173057. Epub 2020 Mar 2. PMID: 32135122.
[7] He B, Guo W, Shi R, Hoffman RD, Luo Q, Hu YJ, Gao J. Ruyong formula improves thymus function of CUMS-stimulated breast cancer mice. J Ethnopharmacol. 2023 Sep 16;319(Pt 1):117164. doi: 10.1016/j.jep.2023.117164. Epub ahead of print. PMID: 37717843.
