Cell Reports揭示糖尿病腎病新機(jī)制：乳酸化修飾TRIM65驅(qū)動(dòng)腎小管損傷

作為糖尿病主要微血管并發(fā)癥，糖尿病腎�。―KD）以腎功能漸進(jìn)性喪失和腎間質(zhì)纖維化為核心，腎小管上皮細(xì)胞（TEC）損傷是疾病進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。DKD中TEC存在線粒體功能障礙，導(dǎo)致能量代謝從脂肪酸氧化轉(zhuǎn)向糖酵解，引發(fā)乳酸積累；乳酸并非被動(dòng)代謝產(chǎn)物，而是主動(dòng)調(diào)控TEC損傷的信號(hào)分子，但具體機(jī)制不明。深圳市人民醫(yī)院楊書、南昌大學(xué)姜玫秀、北京大學(xué)深圳醫(yī)院梁真研究團(tuán)隊(duì)在Cell Reports (IF6.9)發(fā)文“TRIM65 as a key regulator of ferroptosis and glycolysis in lactate-driven renal tubular injury and diabetic kidney disease”，研究揭示乳酸誘導(dǎo)的TRIM65在K206位點(diǎn)的乳酸化修飾，會(huì)損害其在抑制鐵死亡和糖酵解中的雙重調(diào)控作用，進(jìn)而推動(dòng)DKD的進(jìn)展，同時(shí)也明確了潛在的治療靶點(diǎn)。
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病毒產(chǎn)品：AAV9-Ksp1.3-Trim65、AAV9-Ksp1.3-Trim65 K206R、AAV9-Ksp1.3-null
注射方式：腎臟原位注射

研究結(jié)果
1、TRIM65通過(guò)泛素化降解IREB2與PDK4抑制鐵死亡和糖酵解，對(duì)抗糖尿病腎病
單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)的再分析鑒定出TRIM65主要在腎小管上皮細(xì)胞（TEC）中高表達(dá)。在糖尿病相關(guān)條件刺激下，TEC中IREB2的蛋白及mRNA水平均顯著升高，且乳酸對(duì)IREB2表達(dá)的誘導(dǎo)作用強(qiáng)于HGPA，提示乳酸是調(diào)控IREB2的關(guān)鍵代謝信號(hào)。內(nèi)源性及外源性Co-IP等實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TRIM65可與IREB2直接相互作用，并且TRIM65主要通過(guò) K48 型泛素鏈介導(dǎo)IREB2泛素化。鑒于IREB2是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，研究團(tuán)隊(duì)探索了TRIM65是否參與鐵死亡的調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)TRIM65依賴IREB2抑制乳酸誘導(dǎo)的鐵死亡，且該調(diào)控在乳酸積累的病理狀態(tài)下更顯著。除了與鐵死亡相關(guān)的基因外，研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)糖酵解關(guān)鍵調(diào)控基因PDK4在TRIM65 KO后蛋白水平顯著增加，數(shù)據(jù)表明PDK4是TRIM65的直接靶標(biāo)，TRIM65促進(jìn)PDK4的泛素化和隨后的降解。進(jìn)一步的分析證實(shí)TRIM65參與乳酸介導(dǎo)的TEC糖酵解能力上調(diào)，且這種調(diào)節(jié)依賴于PDK4。隨后，研究人員探索了TRIM65在DKD進(jìn)展中的潛在作用，發(fā)現(xiàn)Trim65 TKO（腎小管特異性敲除）使糖尿病小鼠的腎損傷惡化，并加重了DKD小鼠腎臟中的脂質(zhì)積累、氧化應(yīng)激異常及炎癥，此外Trim65 TKO DKD小鼠腎臟中，IREB2和PDK4蛋白水平顯著升高，而二者的泛素化水平降低。表明TRIM65缺乏通過(guò)促進(jìn)糖酵解、鐵凋亡和炎癥加劇DKD，突出了其作為DKD治療靶點(diǎn)的潛力。

2、TRIM65在TECs中的過(guò)表達(dá)賦予糖尿病小鼠對(duì)腎損傷的抵抗力
通過(guò)攜帶腎小管特異性啟動(dòng)子的腺相關(guān)病毒，向野生型糖尿病小鼠腎臟TEC中特異性過(guò)表達(dá)TRIM65，Western blot驗(yàn)證顯示AAV9-Trim65轉(zhuǎn)染后，糖尿病小鼠腎臟中TRIM65蛋白水平顯著升高，且其下游靶蛋白IREB2和PDK4的蛋白水平降低、泛素化水平升高，證實(shí)TRIM65在TEC中成功過(guò)表達(dá)并恢復(fù)了對(duì)IREB2和PDK4的泛素化降解功能。不僅如此，TRIM65 過(guò)表達(dá)顯著緩解了糖尿病誘導(dǎo)的腎臟損傷，減少了糖尿病小鼠腎臟的脂質(zhì)積累和氧化應(yīng)激，同時(shí)降低了糖尿病小鼠腎臟的乳酸含量，下調(diào)了糖酵解關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)，改善了糖酵解異常；此外，腎臟中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA水平顯著降低，炎癥反應(yīng)得到抑制。機(jī)制上，經(jīng)預(yù)測(cè)及突變實(shí)驗(yàn)證實(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)TRIM65的K206位點(diǎn)是關(guān)鍵乳酸化位點(diǎn)，TRIM65乳酸化隨DKD進(jìn)展升高，且與IREB2、PDK4蛋白水平正相關(guān)、泛素化水平負(fù)相關(guān)，還與 DKD 嚴(yán)重程度正相關(guān)，表明TRIM65 K206對(duì)于調(diào)節(jié)乳酸刺激下的糖酵解反應(yīng)和鐵死亡是關(guān)鍵的。

3、乳酸刺激下p300介導(dǎo)TRIM65 K206位點(diǎn)的乳酸化
將AAV9-Trim65和AAV9-Trim65 K206R轉(zhuǎn)染到TRIM65 KO小鼠的腎臟中，并誘導(dǎo)DKD模型。結(jié)果顯示，野生型TRIM65可逆轉(zhuǎn)TRIM65 KO導(dǎo)致的DKD腎損傷，而TRIM65 K206R突變體對(duì)DKD的保護(hù)效果更顯著；同時(shí)，兩種TRIM65均可下調(diào)KO小鼠腎臟中IREB2和PDK4的蛋白水平，證實(shí) TRIM65的K206乳酸化是小鼠DKD發(fā)病的關(guān)鍵因素，該位點(diǎn)乳酸化缺失可增強(qiáng)TRIM65的抗DKD作用。進(jìn)一步的探索分析發(fā)現(xiàn)，p300（乳酸轉(zhuǎn)移酶）可與TRIM65直接結(jié)合（結(jié)合區(qū)域?yàn)門RIM65的A139-260位氨基酸）。在乳酸刺激下，糖尿病模型小鼠腎臟中p300蛋白水平升高，且乳酸會(huì)增強(qiáng)二者相互作用；p300過(guò)表達(dá)能提高TRIM65乳酸化水平，p300抑制劑則可抑制該乳酸化，且 TRIM65 K206R突變會(huì)阻斷p300對(duì)TRIM65乳酸化的促進(jìn)作用，證實(shí)p300是介導(dǎo)乳酸誘導(dǎo)TRIM65 K206位點(diǎn)乳酸化的關(guān)鍵分子。

研究結(jié)論
本研究表明乳酸通過(guò)催化TRIM65蛋白K206位點(diǎn)的乳酸化修飾，抑制其泛素連接酶活性。這一修飾阻止了鐵調(diào)節(jié)蛋白IREB2和糖酵解關(guān)鍵基因PDK4的降解，從而在DKD中驅(qū)動(dòng)鐵死亡和糖酵解過(guò)程。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，無(wú)法被乳酸化的K206R突變體能顯著增強(qiáng)抗DKD療效，由此確立TRIM65乳酸化作為治療DKD的新靶點(diǎn)。