細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞傳代的基本原理與操作步驟及注意事項(xiàng)

細(xì)胞傳代是細(xì)胞培養(yǎng)中維持細(xì)胞活性和增殖的關(guān)鍵操作，通過(guò)將密集生長(zhǎng)的細(xì)胞分散后接種到新的培養(yǎng)容器中，為細(xì)胞提供充足的生長(zhǎng)空間和營(yíng)養(yǎng)，避免細(xì)胞因接觸抑制或營(yíng)養(yǎng)耗盡而停止生長(zhǎng)甚至死亡。以下是關(guān)于細(xì)胞傳代的詳細(xì)介紹：
 
一、細(xì)胞傳代的基本原理
 
大多數(shù)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞（如上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞）在生長(zhǎng)至80%-90% 匯合度（即細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)容器底面的比例）時(shí)，會(huì)因空間不足和營(yíng)養(yǎng)消耗出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯，此時(shí)需通過(guò)胰蛋白酶等消化酶使細(xì)胞脫離基質(zhì)，分散成單個(gè)細(xì)胞后，按一定比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，實(shí)現(xiàn)傳代。
 
懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞（如某些淋巴細(xì)胞）雖無(wú)需消化，但當(dāng)細(xì)胞密度過(guò)高時(shí)，也需通過(guò)稀釋后轉(zhuǎn)移到新容器中傳代。
 
二、細(xì)胞傳代的操作步驟（以貼壁細(xì)胞為例）
 
1、準(zhǔn)備工作
 
試劑：完全培養(yǎng)基（含血清和抗生素）、胰蛋白酶（常用 0.25% 胰酶 - EDTA 混合液，EDTA 輔助細(xì)胞脫離）、PBS 緩沖液（無(wú)鈣鎂離子，避免影響胰酶活性）。
 
器材：超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)瓶 / 皿、移液槍及槍頭、離心管、酒精燈等，需提前滅菌并在超凈臺(tái)內(nèi)紫外線消毒 30 分鐘。
 
細(xì)胞狀態(tài)檢查：在顯微鏡下觀察細(xì)胞匯合度，確認(rèn)無(wú)污染（如無(wú)懸浮雜質(zhì)、培養(yǎng)液清澈），生長(zhǎng)狀態(tài)良好（細(xì)胞形態(tài)完整、透亮）。
 
2、具體操作
 
棄去舊培養(yǎng)基：傾斜培養(yǎng)瓶，輕輕吸去或倒出舊培養(yǎng)液，避免直接沖擊細(xì)胞層。
 
洗滌細(xì)胞：加入適量 PBS（如 T25 培養(yǎng)瓶加 2-3mL），輕輕晃動(dòng)后棄去，目的是洗去殘留血清（血清會(huì)抑制胰酶活性）。
 
消化細(xì)胞：加入適量胰酶（覆蓋細(xì)胞層即可，如 T25 瓶加 1-2mL），37℃培養(yǎng)箱中靜置 1-3 分鐘（不同細(xì)胞消化時(shí)間不同，需在顯微鏡下觀察：細(xì)胞變圓、間隙增大即消化完成）。
 
終止消化：加入等量或過(guò)量的完全培養(yǎng)基（含血清），終止胰酶作用，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞層，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液。
 
計(jì)數(shù)與接種：取少量細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，按所需密度（如 1×10⁵-5×10⁵個(gè) /mL）接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，輕輕搖勻，標(biāo)記細(xì)胞名稱、傳代日期和代數(shù)。
 
培養(yǎng)：將新接種的細(xì)胞放入 37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日觀察細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)情況。
 
三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
 
1、消化時(shí)間控制
 
胰酶消化過(guò)度會(huì)損傷細(xì)胞（導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂），消化不足則細(xì)胞分散不完全（成團(tuán)生長(zhǎng)，影響傳代效率）。需根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整時(shí)間（如上皮細(xì)胞較易消化，成纖維細(xì)胞可能需更長(zhǎng)時(shí)間）。
 
2、避免污染
 
操作全程在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，嚴(yán)格無(wú)菌操作：手消毒、器材火焰灼燒（如瓶口）、避免試劑瓶口接觸其他物品。
 
若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液渾濁（細(xì)菌污染）、出現(xiàn)白色 / 黑色斑點(diǎn)（真菌污染），需立即丟棄細(xì)胞，避免污染擴(kuò)散。
 
3、傳代比例
 
根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度調(diào)整傳代比例（如快速生長(zhǎng)的細(xì)胞 1:5-1:10 傳代，慢速生長(zhǎng)的細(xì)胞 1:2-1:3 傳代），確保傳代后細(xì)胞有足夠空間生長(zhǎng)，避免密度過(guò)高或過(guò)低。
 
4、細(xì)胞代數(shù)管理
 
原代細(xì)胞和有限傳代細(xì)胞有壽命限制，需記錄傳代次數(shù)，避免過(guò)度傳代導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變或功能異常。無(wú)限細(xì)胞系雖可長(zhǎng)期傳代，但也需定期凍存，防止突變。
 
四、懸浮細(xì)胞傳代的特殊點(diǎn)
 
無(wú)需胰酶消化，直接將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，1000-1500rpm 離心 5 分鐘，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按適當(dāng)比例接種到新培養(yǎng)瓶即可。
 
細(xì)胞傳代是細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)技術(shù)，熟練掌握操作細(xì)節(jié)（如消化時(shí)間、無(wú)菌控制）是保證細(xì)胞活力和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的關(guān)鍵。不同細(xì)胞類型的特性差異較大，建議根據(jù)具體細(xì)胞的培養(yǎng)手冊(cè)調(diào)整操作參數(shù)。