腫瘤/纖維化EMT研究中mIHC染色指標(biāo)的組合及選擇方法

在選擇上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化（MET）的多重免疫組化（mIHC）染色指標(biāo)時(shí)，核心原則是同時(shí)標(biāo)記上皮細(xì)胞標(biāo)志物、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物及關(guān)鍵調(diào)控因子，通過(guò)多指標(biāo)共定位分析，直觀呈現(xiàn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)過(guò)程（如上皮標(biāo)志物丟失、間質(zhì)標(biāo)志物獲得，或反之）。以下從指標(biāo)分類、組合策略、注意事項(xiàng)三方面詳細(xì)說(shuō)明：

一、核心指標(biāo)分類：上皮標(biāo)志物、間質(zhì)標(biāo)志物、調(diào)控因子
1. 上皮細(xì)胞標(biāo)志物（核心功能：指示上皮表型完整性）
用于識(shí)別細(xì)胞是否保留上皮特性，EMT過(guò)程中通常表達(dá)下調(diào)或丟失，MET過(guò)程中重新上調(diào)或恢復(fù)。

2. 間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（核心功能：指示間質(zhì)表型獲得）
用于識(shí)別細(xì)胞是否獲得間質(zhì)特性，EMT過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，MET過(guò)程中表達(dá)下調(diào)或丟失。

3. EMT/MET關(guān)鍵調(diào)控因子（核心功能：解釋表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制）
用于定位調(diào)控EMT/MET的信號(hào)分子，明確“誰(shuí)在驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)化”，通常與上皮/間質(zhì)標(biāo)志物共定位分析。

二、mIHC指標(biāo)組合策略：按研究目標(biāo)設(shè)計(jì)“3-4指標(biāo)組合”
mIHC的優(yōu)勢(shì)是同時(shí)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)，需根據(jù)研究對(duì)象（腫瘤/纖維化/胚胎發(fā)育）和核心問(wèn)題（僅觀察表型？還是探究機(jī)制？）設(shè)計(jì)組合，避免指標(biāo)過(guò)多導(dǎo)致信號(hào)重疊（通常一次檢測(cè)3-4個(gè)指標(biāo)，選擇不同種屬來(lái)源一抗，搭配不同熒光素二抗）。

1. 基礎(chǔ)組合：僅觀察EMT/MET表型（無(wú)機(jī)制探究）
核心邏輯：上皮標(biāo)志物 + 間質(zhì)標(biāo)志物（必選）+ 細(xì)胞定位對(duì)照（如DAPI染核），適合快速判斷“是否發(fā)生轉(zhuǎn)化”。

· 通用組合（所有組織）：E-cadherin（上皮）+ Vimentin（間質(zhì)）+ DAPI
→ 結(jié)果判讀：正常上皮細(xì)胞僅E-cadherin+，間質(zhì)細(xì)胞僅Vimentin+；EMT細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩者（“雙陽(yáng)性”）或E-cadherin-、Vimentin+；MET細(xì)胞則相反。
· 腫瘤特異性組合：CKpan（上皮）+ N-cadherin（間質(zhì)）+ DAPI
→ 優(yōu)勢(shì)：CKpan特異性識(shí)別腫瘤上皮細(xì)胞，避免與正常間質(zhì)細(xì)胞混淆，適合腫瘤轉(zhuǎn)移灶的EMT檢測(cè)。
· 纖維化特異性組合：E-cadherin（上皮）+ α-SMA（肌成纖維細(xì)胞間質(zhì)）+ DAPI
→ 適合肺/肝/腎纖維化中“上皮→肌成纖維細(xì)胞”轉(zhuǎn)化的檢測(cè)。

2. 進(jìn)階組合：表型 + 機(jī)制探究（推薦）
核心邏輯：上皮標(biāo)志物 + 間質(zhì)標(biāo)志物 + 調(diào)控因子 + DAPI，適合明確“調(diào)控因子是否驅(qū)動(dòng)表型轉(zhuǎn)化”。
· 腫瘤EMT機(jī)制組合：E-cadherin（上皮）+ Vimentin（間質(zhì)）+ Snail（調(diào)控因子）+ DAPI
→ 結(jié)果判讀：若Snail核陽(yáng)性的細(xì)胞同時(shí)出現(xiàn)E-cadherin下調(diào)、Vimentin上調(diào)，提示Snail驅(qū)動(dòng)該區(qū)域EMT。
· TGF-β通路相關(guān)組合：E-cadherin（上皮）+ α-SMA（間質(zhì)）+ TGF-βRⅡ（調(diào)控因子）+ DAPI
→ 適合纖維化研究，判斷TGF-β受體激活是否與上皮→肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)。

三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
1. 一抗種屬與熒光素匹配：
mIHC可以選擇相同種屬來(lái)源的一抗；染色順序遵循先弱后強(qiáng)的原則（如CKpan這種泛表達(dá)指標(biāo)可以放最后一輪搭配波長(zhǎng)最長(zhǎng)的TSA染料）

2. 組織特異性調(diào)整：
- 避免選擇與組織背景交叉的標(biāo)志物（如肝臟中，CK18特異性標(biāo)記肝細(xì)胞，而CKpan可能與膽管上皮交叉，需優(yōu)先選CK18）；
- 間質(zhì)豐富的組織（如肺、腎臟），可增加“內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物”（如CD31）排除內(nèi)皮細(xì)胞干擾，明確Vimentin+細(xì)胞是否為EMT來(lái)源（而非正常內(nèi)皮/成纖維細(xì)胞）。

3. 陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照：
- 陽(yáng)性對(duì)照：已知發(fā)生EMT的組織（如腫瘤侵襲前沿、肺纖維化病灶）；已知MET的組織（如腫瘤轉(zhuǎn)移灶中分化較好的區(qū)域）；
- 陰性對(duì)照：正常上皮組織（僅上皮標(biāo)志物+）、正常間質(zhì)組織（僅間質(zhì)標(biāo)志物+），以及“一抗替代對(duì)照”（用同型IgG替代特異性一抗，排除非特異性染色）。

4. 結(jié)果量化指標(biāo)：
僅觀察“陽(yáng)性/陰性”不夠，需通過(guò)圖像分析軟件（如ImageJ、QuPath）量化：
- EMT細(xì)胞比例：（E-cadherin-Vimentin+細(xì)胞數(shù) + E-cadherin+Vimentin+細(xì)胞數(shù)）/ 總上皮細(xì)胞數(shù)；
- 共定位系數(shù)：調(diào)控因子（如Snail）與間質(zhì)標(biāo)志物（如Vimentin）的共定位Pearson系數(shù)，判斷兩者是否協(xié)同表達(dá)。

綜上，EMT/MET的mIHC指標(biāo)選擇需圍繞“表型識(shí)別（上皮 + 間質(zhì)）+ 機(jī)制驗(yàn)證（調(diào)控因子）”核心，結(jié)合研究對(duì)象調(diào)整組合，并嚴(yán)格控制對(duì)照與量化分析，才能準(zhǔn)確反映轉(zhuǎn)化過(guò)程及分子機(jī)制。