小鼠模型在揭示PKM2介導(dǎo)組蛋白乳酸化調(diào)控多囊卵巢綜合征機制中的應(yīng)用

11月19日，復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院黃荷鳳院士團隊聯(lián)合楊紅波、劉欣研究員團隊，在國際知名期刊Signal Transduction and Targeted Therapy（STTT，IF=52.7）發(fā)表題為“Pyruvate kinase M2-mediated histone lactylation alters three-dimensional genomic architecture in polycystic ovary syndrome”的重磅研究成果。該研究首次揭示了丙酮酸激酶M2（PKM2）核易位后通過調(diào)控組蛋白乳�；�、重塑基因組三維結(jié)構(gòu)，驅(qū)動多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）發(fā)生的分子機制，為PCOS的精準(zhǔn)治療提供了全新靶點。

南模生物為該研究構(gòu)建了Rosa26-loxP-Stop-loxP-Pkm2-2A-tdTomato小鼠模型。

多囊卵巢綜合征（PCOS）是育齡期女性高發(fā)的內(nèi)分泌代謝疾病，以高雄激素血癥、排卵障礙和多囊卵巢形態(tài)為核心特征，是導(dǎo)致女性不孕的主要原因之一。以往研究表明，代謝紊亂與表觀遺傳調(diào)控異常參與PCOS發(fā)生發(fā)展，但其具體的分子機制仍不明確。因此，解析代謝-表觀遺傳調(diào)控軸在PCOS中的作用，尋找潛在治療靶點，已成為該領(lǐng)域亟待突破的關(guān)鍵科學(xué)問題。

糖酵解酶與多囊卵巢綜合征相關(guān)性的聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)和孟德爾隨機化分析
為探究糖酵解酶與PCOS的相關(guān)性，研究團隊對PCOS患者與對照組顆粒細(xì)胞（granulocyte，GCs）進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析（圖1a）。結(jié)果顯示，共鑒定出430個差異表達蛋白，其中代謝過程在顯著富集的通路中位居前列（圖1b）；關(guān)鍵糖酵解酶核丙酮酸激酶M2（PKM2）在PCOS患者GCs中顯著上調(diào)，且在女性生殖組織中特異性高表達（圖1c、d）。

進一步通過孟德爾隨機化（MR）分析發(fā)現(xiàn)，遺傳預(yù)測的PKM2水平升高與PCOS風(fēng)險存在顯著因果關(guān)聯(lián)（OR=1.35, 95% CI 1.07–1.71）（圖1f、g），且敏感性分析支持該結(jié)果的穩(wěn)健性（圖1h、i）。以上結(jié)果表明，PKM2是驅(qū)動PCOS發(fā)病的核心候選因子。

Fig1. 蛋白質(zhì)組學(xué)與孟德爾隨機化分析確認(rèn)PKM2為PCOS關(guān)鍵候選因子

Fig2. PCOS 患者GCs細(xì)胞核中PKM2的積累

GCs中特異性過表達PKM2誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)PCOundefinedS表型
為研究PKM2上調(diào)對PCOS發(fā)生發(fā)展是否具有關(guān)鍵作用，研究團隊將Rosa26-loxP-Stop-loxP-Pkm2-2A-tdTomato（TG PKM2^fl/fl tdTomato）小鼠與AMH-Cre小鼠進行交配，獲得了在卵巢GCs中特異性過表達Pkm2的小鼠（圖3a）。結(jié)果表明，該小鼠出現(xiàn)典型PCOS樣特征：動情周期紊亂（圖3d、e），血清睪酮和抗穆勒管激素（AMH）水平顯著升高，生育率下降（圖3f-h）；此外，H&E染色結(jié)果顯示，與對照組小鼠相比，GCs特異性過表達Pkm2的小鼠黃體數(shù)量減少，小卵泡數(shù)量增多（圖3i）。Whole-Mount熒光和免疫染色顯示，tdTomato表達主要定位于卵巢GCs，卵巢GCs中特異性過表達Pkm2小鼠卵巢中含有大量小卵泡，表明該小鼠排卵障礙（圖3j、k）。

Fig3. 顆粒細(xì)胞特異性過表達PKM2促進PCOS樣生殖功能障礙

PKM2的核積累改變了全局組蛋白乳酸化格局，并增強PCOS相關(guān)基因的表達
研究發(fā)現(xiàn)，核PKM2過表達顯著增加細(xì)胞核內(nèi)乳酸濃度，且高雄激素PCOS患者血漿與卵泡液中乳酸水平明顯升高（圖4a、b）。進一步CUT&Tag分析顯示，核PKM2使組蛋白H3的K9、K18及K27位點乳酸化修飾全局性增強，超過70%的組蛋白乳酸化差異峰在核PKM2細(xì)胞中上調(diào)（圖4k），并與PKM2基因組結(jié)合位點高度重疊。這種表觀遺傳重塑導(dǎo)致266個基因顯著上調(diào)，其中包括雄激素合成關(guān)鍵基因CYP17A1、CYP11A1以及PCOS相關(guān)基因WNT4、PADI3等（圖4i），這些基因主要富集于激素代謝與膽固醇生物合成通路（圖4j）。此外，研究團隊觀察到組蛋白乳�；瘯�誘導(dǎo)基因組抑制區(qū)域轉(zhuǎn)為活躍狀態(tài)，CTCF結(jié)合減少并增加染色質(zhì)環(huán)數(shù)量。上述結(jié)果表明，PKM2的核積累、染色質(zhì)結(jié)合增強、H3K9la修飾增強以及CTCF結(jié)合減少共同促進nPKM2細(xì)胞染色質(zhì)狀態(tài)更活躍，導(dǎo)致染色質(zhì)構(gòu)象的全局變化，進而促進與PCOS相關(guān)基因的表達。

Fig4. 核PKM2誘導(dǎo)的全局組蛋白乳化及PCOS相關(guān)基因的上調(diào)

組蛋白乳酸化增加改變基因組的三維結(jié)構(gòu)
為探索核PKM2通過組蛋白乳酸化對基因組三維結(jié)構(gòu)的調(diào)控機制，研究團隊使用Hi-C技術(shù)分析了核PKM2過表達細(xì)胞與PKM2敲除細(xì)胞的染色質(zhì)構(gòu)象（圖5a）。結(jié)果顯示，核PKM2導(dǎo)致基因組中7.05%的區(qū)域發(fā)生B型區(qū)室向A型區(qū)室的轉(zhuǎn)換，伴隨組蛋白乳酸化信號在轉(zhuǎn)換區(qū)域顯著增強（圖5b、c），表明染色質(zhì)狀態(tài)更趨活躍。在拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD）層面，核PKM2結(jié)合使TAD邊界絕緣評分降低、CTCF結(jié)合減少，引發(fā)TAD融合事件（圖5d-h）。染色質(zhì)環(huán)分析顯示，核PKM2使染色質(zhì)環(huán)總數(shù)顯著增加（2567 vs 1315），且環(huán)錨定點富集組蛋白乳酸化信號（圖5i-j）。值得注意的是，雄激素合成關(guān)鍵基因CYP17A1形成新的染色質(zhì)環(huán)，使其啟動子與410 kb外的增強子區(qū)域相互作用，導(dǎo)致該基因表達上調(diào)49倍（圖5k）。以上結(jié)果表明，核PKM2通過組蛋白乳酸化重塑基因組三維結(jié)構(gòu)，促進PCOS相關(guān)基因表達。

Fig5. 核PKM2介導(dǎo)的組蛋白乳酸化驅(qū)動KGN細(xì)胞三維基因組構(gòu)象重構(gòu)

抑制PKM2核轉(zhuǎn)運可逆轉(zhuǎn)PCOS樣表型
為探索其治療潛力，研究團隊使用TEPP-46（PKM2核轉(zhuǎn)運抑制劑）處理脫氫表雄酮（DHEA）誘導(dǎo)的PCOS小鼠模型（DHEA誘導(dǎo)可導(dǎo)致睪酮水平升高）（圖6a）。結(jié)果顯示，TEPP-46處理后囊狀卵泡和黃體數(shù)量與野生型小鼠相似（圖6b），小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的PKM2水平顯著降低（圖6c），動情周期正常節(jié)律恢復(fù)（圖6d、e），血清睪酮水平降低并生育率得到改善（圖6f、g）。同時，對卵巢GCs進行RNA-seq進行分析，結(jié)果顯示，PCOS樣小鼠中前300個上調(diào)基因被TEPP-46治療抑制，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄譜與WT小鼠相似（圖6h），進一步qPCR驗證，在TEPP-46處理的小鼠卵巢GCs中，PCOS相關(guān)基因如Pkm2、Wnt4、Klhl30、Avpi1、Padi3、Cyp11a1和Cyp17a1下調(diào)至WT小鼠水平（圖6j），即TEPP-46可抑制PCOS相關(guān)基因的異常表達。以上結(jié)果表明，靶向PKM2核轉(zhuǎn)運是治療PCOS的有效策略。

Fig6. TEPP-46逆轉(zhuǎn)了PCOS樣小鼠表型和 PCOS 相關(guān)基因的上調(diào)

總之，研究團隊闡明了PKM2（一種關(guān)鍵的代謝酶）的失調(diào)在PCOS發(fā)病機制中的作用，并強調(diào)了組蛋白乳酸化在3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中的重要性。GCs中PKM2的上調(diào)和核易位導(dǎo)致組蛋白乳酸化格局的改變，進而促進PCOS中3D基因組組織的全球變化。PKM2介導(dǎo)的組蛋白乙酰化導(dǎo)致更活躍的染色質(zhì)狀態(tài)，允許某些遠端增強子通過新形成的環(huán)接近關(guān)鍵PCOS相關(guān)基因(如CPZ和CYP17A1)的啟動子，從而增加這些基因的表達。小分子TEPP-46調(diào)節(jié)PKM2活性并挽救PCOS樣表型的能力表明PKM2是治療PCOS的一個新的有前途的治療靶點。

Fig7. 研究模式圖

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上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，簡稱"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科創(chuàng)板上市高科技生物公司（股票代碼：688265），始終以編輯基因、解碼生命為己任，專注于模式生物領(lǐng)域，打造了以基因修飾動物模型研發(fā)為核心，涵蓋多物種模型構(gòu)建、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥物臨床前評價等多個技術(shù)平臺，致力于為全球高校、科研院所、制藥企業(yè)等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動物模型產(chǎn)品解決方案。

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