無標記活細胞成像技術應用于高時空分辨率捕捉蛋白結構變化
本文介紹了一項發(fā)表于《Nature Biomedical Engineering》的創(chuàng)新研究，開發(fā)了一種名為中紅外光聲顯微鏡（MiROM）的無標記活細胞成像技術。該技術能夠敏感地檢測蛋白質二級結構變化，特別是在多發(fā)性骨髓瘤治療中，通過監(jiān)測β-折疊結構的形成來評估患者對藥物的反應。傳統(tǒng)方法如流式細胞術或免疫印跡需要熒光標記或大量細胞，且只能提供群體水平的快照信息，而MiROM技術實現(xiàn)了單細胞水平、實時、縱向的評估，僅需少量細胞即可完成。
本研究的核心貢獻者包括Francesca Gasparin、Marlene R. Tietje、Eslam Katab、Aizada Nurdinova、Tao Yuan、Andriy Chmyrov、Nasire Uluc、Dominik Jüstel、Florian Bassermann、Vasilis Ntziachristos和Miguel A. Pleitez。文章標題為“Label-free protein-structure-sensitive live-cell microscopy for patient-specific assessment of myeloma therapy”，于2025年7月14日在《Nature Biomedical Engineering》期刊上在線發(fā)表。
重要發(fā)現(xiàn)
01技術原理與基礎驗證
MiROM技術基于光聲效應原理，通過中紅外激光激發(fā)生物分子振動，并檢測產(chǎn)生的超聲波信號來實現(xiàn)成像。與傳統(tǒng)中紅外光譜不同，MiROM采用正對比機制，即光學吸收越強，超聲波信號越強，從而克服了水吸收導致的靈敏度限制。研究團隊首先在蛋白質溶液體系中驗證了MiROM的特異性，例如血紅蛋白（以α-螺旋為主）和伴刀豆球蛋白A（以β-折疊為主）的光譜顯示，MiROM能夠清晰區(qū)分不同二級結構特征，與標準ATR-FTIR光譜結果一致。
進一步地，團隊通過熱變性實驗展示了MiROM檢測蛋白質構象變化的能力。白蛋白在天然狀態(tài)下顯示α-螺旋特征峰（1654 cm⁻¹），而變性后出現(xiàn)β-折疊峰（1612 cm⁻¹），這證實了MiROM對蛋白質折疊狀態(tài)的敏感性。在活細胞應用中，團隊使用HeLa細胞在D₂O/H₂O混合培養(yǎng)基中進行成像，發(fā)現(xiàn)D₂O比例越高，圖像對比度越強，最高可達純水環(huán)境的3.4倍，且細胞活性在70% D₂O中保持93.8%，證明了技術的生物相容性。
02骨髓瘤治療響應監(jiān)測在多發(fā)性骨髓瘤模型中，MiROM被用于評估蛋白酶體抑制劑（如bortezomib, BTZ）和免疫調(diào)節(jié)藥物（如lenalidomide, LEN）的治療效果。這些藥物通過抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，導致錯誤折疊蛋白積累和細胞凋亡。研究團隊在MM1.S細胞系中觀察到，藥物處理后，光譜分析顯示1612 cm⁻¹處出現(xiàn)β-折疊特征峰，表明錯誤折疊蛋白聚集。這一現(xiàn)象在聯(lián)合用藥（LEN/BTZ）或單獨用藥時均被檢測到，且隨時間推移信號增強，而對照組或無相關藥物作用的細胞（如使用doxorubicin）則無此變化。
通過非負矩陣分解（NMF）分析，團隊提取了5個光譜組分，其中組分2（1618 cm⁻¹）和組分4（1666 cm⁻¹）分別對應β-折疊和α-螺旋結構。在治療組中，β-折疊組分顯著增加（96小時后上升174%），而α-螺旋組分下降，進一步驗證了MiROM的定量能力。t-SNE聚類分析顯示，治療后細胞光譜與對照組明顯分離，突出了技術的單細胞分辨率優(yōu)勢。
03患者樣本的臨床應用在臨床轉化層面，MiROM被應用于9名新診斷骨髓瘤患者的原代CD138+細胞中。結果顯示，敏感患者細胞在LEN/BTZ處理后，β-折疊信號增強，響應細胞比例平均達53%，而對照組僅為20%。對于復發(fā)/難治性患者，MiROM成功預測了藥物抵抗情況：例如，一名對LEN抵抗但對BTZ敏感的患者，檢測到β-折疊形成，與臨床結局一致。這證明了MiROM在個性化治療評估中的潛力，僅需少量細胞即可實現(xiàn)實時監(jiān)測。
創(chuàng)新與亮點
01突破成像難題
MiROM技術解決了傳統(tǒng)光學顯微鏡在蛋白質二級結構檢測中的核心瓶頸。可見光區(qū)技術缺乏特異性，而常規(guī)中紅外光譜受水吸收干擾，需使用超薄路徑或同步輻射光源，易造成細胞損傷。MiROM通過光聲探測機制，將光學吸收轉化為聲信號，實現(xiàn)了在生理條件下對活細胞的無標記成像。其靈敏度在酰胺I區(qū)（1700-1600 cm⁻¹）可達信號變化1%，遠高于拉曼顯微鏡等技術，為蛋白質動態(tài)研究提供了新途徑。
MiROM的創(chuàng)新性體現(xiàn)在其正對比成像能力上。與負對比的傳統(tǒng)中紅外方法不同，MiROM的信號強度隨吸收增加而提升，避免了光子損失問題。同時，技術結合D₂O培養(yǎng)基優(yōu)化，在保持細胞活性的前提下提升了對比度。此外，MiROM具備高時空分辨率（橫向分辨率約6μm），可進行單細胞縱向追蹤，克服了流式細胞術或免疫印跡所需的大量細胞樣本限制。
總結與展望
本研究開發(fā)的MiROM技術成功實現(xiàn)了無標記、蛋白質結構敏感的活細胞成像，為多發(fā)性骨髓瘤治療評估提供了高效、微創(chuàng)的新方法。通過檢測β-折疊結構作為生物標志物，MiROM能夠在單細胞水平實時監(jiān)測藥物響應，克服了傳統(tǒng)技術的局限性。未來，通過優(yōu)化激光參數(shù)和成像速度，MiROM可進一步提升靈敏度并擴大應用范圍，如用于其他癌癥或神經(jīng)退行性疾病研究。展望中，該技術有望成為臨床標準工具，幫助醫(yī)生快速測試多種藥物組合，優(yōu)化患者特異性治療方案，最終提升治療效果并減少患者痛苦。
聲明：本文僅用作學術目的。
Gasparin F, Tietje MR, Katab E, Nurdinova A, Yuan T, Chmyrov A, Uluç N, Jüstel D, Bassermann F, Ntziachristos V, Pleitez MA. Label-free protein-structure-sensitive live-cell microscopy for patient-specific assessment of myeloma therapy. Nat Biomed Eng. 2025 Jul 14
DOI:10.1038/s41551-025-01443-3.
