基因治療 HEK293 工程株單克隆培養(yǎng)流程優(yōu)化

人胚胎腎（HEK）細(xì)胞，尤其是經(jīng)過基因編輯的 HEK293 衍生物，是基因治療和生物制品開發(fā)常用的細(xì)胞株。目前，越來越多的應(yīng)用涉及 HEK 單克隆細(xì)胞庫的建立，但是 HEK 單細(xì)胞的生長仍然是一個持續(xù)存在的瓶頸。在單細(xì)胞分選后，細(xì)胞的恢復(fù)率通常較低，且克隆形成不穩(wěn)定，這導(dǎo)致項目周期延長、耗材及試劑用量增加。而傳統(tǒng)的補充劑或條件培養(yǎng)基往往存在變異性且制備過程繁瑣的問題。故優(yōu)化 HEK 單克隆培養(yǎng)體系是非常關(guān)鍵的。

NewBiologix 是一家專注于基因治療應(yīng)用的工程化 HEK293 細(xì)胞株平臺（Xcell™ Eng-HEK293）的生物技術(shù)公司，該公司致力于 HEK293 細(xì)胞株培養(yǎng)體系的優(yōu)化。本文介紹了 NewBiologix 使用 InstiGRO HEK 優(yōu)化 HEK 293 單細(xì)胞培養(yǎng)體系的經(jīng)驗，并將其與另一種常用的補充劑（Suppl. Mix A）進(jìn)行了對比，實驗表明 InstiGRO 能夠顯著促進(jìn) HEK293 單細(xì)胞活率，提高篩選效率。

材料與方法 

細(xì)胞株：NewBiologix 在所有實驗中使用了經(jīng)過工程改造的 HEK293 細(xì)胞株，即 Xcell™ Eng-HEK293。細(xì)胞在 384 孔板中進(jìn)行鋪板，使用的是細(xì)胞分選儀 1（用于實驗 1 和實驗 2）和細(xì)胞分選儀 2（僅用于實驗 2）。
培養(yǎng)基條件：兩個平行實驗分別使用兩種培養(yǎng)基，即稱為培養(yǎng)基 1 和培養(yǎng)基 2。
預(yù)處理條件：對于實驗 1，一組細(xì)胞在分離前用 InstiGRO HEK（1/20）培養(yǎng) 22 小時。另一組細(xì)胞則未進(jìn)行處理。
克隆恢復(fù)率定義：HEK 細(xì)胞在分離后經(jīng)過 10 天的培養(yǎng)，選取直徑≥ 150 微米的克隆團定義為一個有效的克隆團。克隆恢復(fù)率計算公式為：（直徑≥ 150 微米的克隆團孔數(shù)/鋪板單個細(xì)胞的總孔數(shù)）× 100。
補充劑測試條件：
Suppl. Mix A
Suppl. Mix A + 20% CM
InstiGRO^® HEK (1/20 稀釋倍數(shù))
InstiGRO^® HEK (1/20 稀釋倍數(shù)) + 20% CM 

鋪板版型：
實驗 1：使用單細(xì)胞分選儀 1 鋪 2 塊 384 孔板
實驗 2：使用單細(xì)胞分選儀 1鋪 1 塊 384 孔板；使用使用單細(xì)胞分選儀 2 鋪 3 塊 384 孔板。

結(jié)果

在實驗 1 中，Xcell™ Eng-HEK293 細(xì)胞在分離前 22 小時用 InstiGRO HEK 處理或不處理。隨后，分別在兩種培養(yǎng)基類型下測試了四種補充劑條件。如圖 1 所示，1/20 InstiGRO HEK + 20% CM 的組合在兩種培養(yǎng)基和處理條件下均實現(xiàn)了最高的單克隆恢復(fù)率，尤其是在使用培養(yǎng)基 2 且未預(yù)先處理的細(xì)胞中，單克隆恢復(fù)率高達(dá) 64%。

圖1. 不同補劑條件下的單克隆恢復(fù)率。條形圖表示在 Day10 含有直徑 ≥150 微米克隆團的孔的百分比（每種條件 n = 48 孔）。無論是否進(jìn)行預(yù)處理，InstiGRO HEK 相比補劑混合物 A 都顯著提高了克隆恢復(fù)率。

相比于補劑 Mix A,InstiGRO HEK 顯著增加了克隆團直徑。
為了評估克隆團的健康狀況和穩(wěn)定性，我們在單細(xì)胞分離后第 10 天通過成像分析測量了平均克隆直徑。如圖 2 所示，無論是否添加條件培養(yǎng)基（CM），相比于補劑 MixA，InstiGRO HEK 均能促進(jìn)克隆團生長，克隆團直徑更大。無論使用哪種培養(yǎng)基，添加 1/20 InstiGRO HEK 和 20% 條件培養(yǎng)基的條件下，無論是否經(jīng)過預(yù)處理，觀察到的平均克隆團直徑最大。

圖2. 實驗 1 中不同補劑條件下平均克隆團直徑（微米）�？寺�團直徑通過成像進(jìn)行分析。圖中數(shù)據(jù)為每種條件下 48 個孔的平均值。在兩種測試培養(yǎng)基中，InstiGRO HEK 均顯著提高了克隆團大小，與對照補劑相比效果尤為明顯。

不同單細(xì)胞鋪板儀使用 InstiGRO HEK 的單克隆恢復(fù)率保持一致。
在實驗 2 中， 通過使用兩種不同的細(xì)胞分選儀來評估 InstiGRO HEK 性能的可重復(fù)性。Xcell™ Eng-HEK293 細(xì)胞通過細(xì)胞分選儀 1 或細(xì)胞分選儀 2 被分離到 384 孔板中，并在含有補劑 Mix A + 20% 條件培養(yǎng)基（CM）與 1/20 InstiGRO HEK + 20% 條件培養(yǎng)基的條件下評估單克隆恢復(fù)率。

如圖 3 所示，InstiGRO HEK 在兩種細(xì)胞分選儀和培養(yǎng)基條件下均保持了較高的單克隆恢復(fù)率。補劑 mixA 的條件下單克隆恢復(fù)率最高可達(dá) 15% 到 26%，而 InstiGRO HEK 的條件下單克隆恢復(fù)率達(dá)到了 49% 到 52%，這證實了該補劑的穩(wěn)定性，且不受分離方法的影響。

圖3. 實驗 2 中使用兩種不同細(xì)胞分選儀的單克隆恢復(fù)率比較。條形圖表示每種條件下含有直徑 ≥150 微米的存活但克隆團的孔的平均百分比（每種條件 n = 128-384 孔）。在兩種細(xì)胞分選儀中，InstiGRO HEK + 條件培養(yǎng)基（CM）的表現(xiàn)均優(yōu)于補劑 Mix A + 條件培養(yǎng)基（CM）。

討論與結(jié)論

NewBiologix 評估了不同補劑對 HEK293 工程株單克隆工作流程的促進(jìn)作用。在兩個獨立實驗中，無論是否添加條件培養(yǎng)基 CM，InstiGRO HEK 均展現(xiàn)出比補劑 mixA 更高的單細(xì)胞恢復(fù)率和更大的平均克隆團直徑。這些改進(jìn)在兩種不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中均有體現(xiàn)，并且在兩種測試的細(xì)胞分選儀中表現(xiàn)一致。

無需預(yù)處理且?guī)缀醪灰蕾嚄l件培養(yǎng)基即可獲得穩(wěn)定結(jié)果，表明 InstiGRO HEK 為 HEK 細(xì)胞分離后的擴增提供了一種可重復(fù)、易適配的解決方案。這能顯著降低繁瑣工藝，尤其適用于早期開發(fā)階段——此時擴增效率與一致性至關(guān)重要。
 

“InstiGRO HEK 幫助我們實現(xiàn)了穩(wěn)定的高單細(xì)胞恢復(fù)率，并培養(yǎng)出體積大、狀態(tài)健康的克隆團。我們可以快速且輕松地將 InstiGRO HEK 整合到單細(xì)胞分離工作流程中。”

——Melissa Vona

NewBiologix高級研發(fā)工程師

關(guān)于NewBiologix

NewBiologix SA 是一家專注于基因與細(xì)胞治療生產(chǎn)的瑞士生物技術(shù)公司，致力于創(chuàng)新工程化解決方案與前沿技術(shù)。公司憑借在細(xì)胞系工程領(lǐng)域的深厚專長，結(jié)合對基因治療生產(chǎn)痛點的精準(zhǔn)洞察，推出了 Xcell™ 技術(shù)組合，一套可深度解析重組腺相關(guān)病毒（rAAV）質(zhì)量的全流程技術(shù)平臺。通過幫助合作伙伴更快、更安全、更大規(guī)模地生產(chǎn)高可靠性基因療法，NewBiologix 正在重塑患者健康的未來。
了解更多信息請訪問：www.newbiologix.com 

關(guān)于InstiGRO HEK

安達(dá)望（Advanced Instruments） 提供一系列化學(xué)成分明確、無動物源成分的細(xì)胞生長補劑，專為支持 HEK293 細(xì)胞而設(shè)計。InstiTHAW^®、InstiGRO^® 和 InstiSHAKE^® 三款細(xì)胞培養(yǎng)補劑經(jīng)過精心研發(fā)，可全方位助力基因治療開發(fā)，確保細(xì)胞生長與性能達(dá)到卓越水平。 

InstiTHAW HEK：在細(xì)胞凍存與復(fù)蘇過程中提供全面保護，最大限度減少損傷。InstiGRO HEK：在單細(xì)胞分離后及穩(wěn)定細(xì)胞株開發(fā)階段為細(xì)胞提供關(guān)鍵營養(yǎng)，促進(jìn)健康克隆團的形成。InstiSHAKE HEK：優(yōu)化搖瓶培養(yǎng)條件，為重組病毒載體的規(guī)�；�生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。 

特別說明：  

InstiGRO HEK 專為單細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計，能持續(xù)支持單個細(xì)胞生長形成健壯的克隆團。其使用極為便捷——只需將補劑加入培養(yǎng)基，即可直接進(jìn)行單細(xì)胞鋪板，無需額外步驟。