RAYPA培養(yǎng)基自動制備分裝儀在克羅諾桿菌定性檢驗中的應用

方案摘要：本方案以克羅諾桿菌 “富集 - 篩選 - 驗證 - 確證” 為核心檢驗邏輯，深度融合 RAYPA 培養(yǎng)基自動制備分裝儀優(yōu)勢，優(yōu)化 BPW、LST-Vm 及顯色培養(yǎng)基等關鍵培養(yǎng)基制備與分裝流程。儀器通過自動溶解滅菌、定量分裝的無菌閉環(huán)操作，解決人工制備的不均與污染問題。使實驗效率得到有效提升，且程序固化參數(shù)消除個體差異。均一化培養(yǎng)基保障各環(huán)節(jié)檢驗穩(wěn)定性，為克羅諾桿菌定性提供高效、標準化技術支撐。
 
 
方案詳情：
一、實驗原理
       克羅諾桿菌定性檢驗核心是 “富集 - 篩選 - 驗證 - 確證” 的遞進邏輯。先以 BPW 培養(yǎng)基前增菌富集目標菌，再用 LST-Vm 肉湯選擇性增菌抑制雜菌、擴增目標菌。通過克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基的特異性顯色反應，篩選出可疑菌落�？蛇x PCR 鑒定利用特異性引物，靶向擴增目標菌 282bp 特征基因片段，實現(xiàn)分子層面快速驗證。最終通過生化鑒定，依據(jù)克羅諾桿菌獨特的代謝生化特征，排除假陽性，確證菌株身份，最終判定樣品中是否存在該菌。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外,其他設備和材料如下：
① Pipetty 電動移液器；
② 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃士1 ℃,41.5 ℃±1℃；
③ 冰箱:2 ℃~5 ℃,-20 ℃；
④ 恒溫水浴箱:41.5 ℃±1℃；
⑤ 天平:感量 0.1g、0.01g；
⑥ 振蕩器；
⑦ 無菌容器:容量 100mL、200mL、2000 mL；
⑧ 無菌培養(yǎng)皿:直徑90mm；
⑨ pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙；
⑩ 微生物生化鑒定系統(tǒng)；
⑪ PCR儀；
⑫ 離心機:轉(zhuǎn)速≥12000r/min；
⑬ 凝膠成像系統(tǒng)或紫外檢測儀；
⑭ 瓊脂糖水平電泳儀或毛細管電泳儀；
⑮ PCR反應管；
⑯ RAYPA培養(yǎng)基自動制備分裝儀；
 
2、試劑和材料
① 緩沖蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)；
② 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium,mLST-Vm)；
③ 克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基；
④ 胰蛋白胨大豆瓊脂(trypticase soy agar,TSA)；
⑤ 生化鑒定試劑盒；
⑥ 氧化酶試劑；
⑦ L-賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基；
⑧ L-鳥氨酸脫羧酶培養(yǎng)基；
⑨ L-精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基；
⑩ 糖類發(fā)酵培養(yǎng)基；
⑪ 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基；
⑫ 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(its)PCR引物；
⑬ 5U/μL 耐熱 DNA 聚合酶。
⑭ 2.5mmol/dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP、25mmol/L MgCl₂；
⑮ 10×PCR 緩沖液、DNA 提取試劑、商品化 PCR 反應預混液；
⑯ 克羅諾桿菌質(zhì)控菌株；
⑰ 大腸埃希氏菌質(zhì)控菌株；
⑱ 核酸染色劑；
⑲ 分子質(zhì)量標準:100 bp DNA ladder。
⑳ 50×TAE電泳緩沖液、6×DNA加樣緩沖液。
 
三、實驗步驟
1、培養(yǎng)基制備與增菌
① 按照BPW配方稱取干粉試劑，加入指定量去離子水后，儀器啟動自動攪拌溶解功能，同時實時監(jiān)測并調(diào)節(jié)pH至7.2。經(jīng)滅菌后，儀器自動將培養(yǎng)基預熱至41℃±1℃，并無菌分裝900mL至無菌容器中，全程避免人工操作引入的污染風險。
 
② 取100g（mL）檢樣加入上述BPW容器，搖勻后置于36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h±2h，完成目標菌富集。相較于人工制備的BPW，RAYPA儀制備的培養(yǎng)基因成分均一，可確保不同樣品的富集效率一致性，降低批次間誤差。
③提前通過RAYPA制備LST-Vm肉湯，在滅菌后冷卻至適宜溫度時加入萬古霉素，避免高溫破壞藥效。隨后自動分裝10mL至無菌試管中。用Pipetty電動移液器移取1mL前增菌液轉(zhuǎn)入該試管，41.5℃±1℃培養(yǎng)24h±2h完成選擇性增菌。儀器的精準分裝使每支試管的營養(yǎng)濃度和抗生素含量完全一致，有效保證雜菌抑制效果的穩(wěn)定性。
 
2、分離培養(yǎng)
① 通過RAYPA按照配方制備顯色培養(yǎng)基，儀器的恒溫保溫模塊將培養(yǎng)基穩(wěn)定控制在45℃±1℃，并通過無菌分裝功能向90mm培養(yǎng)皿中精準注入20mL培養(yǎng)基，確保培養(yǎng)基厚度均一。人工制備常出現(xiàn)的厚度不均、邊緣凝固等問題被徹底解決，為菌落生長形態(tài)一致性提供基礎。
 
② 混勻LST-Vm肉湯培養(yǎng)物，用Pipetty電動移液器吸取10μL，分別劃線接種于2個上述顯色培養(yǎng)基平板，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。因培養(yǎng)基均一性提升，可疑菌落的顯色反應更穩(wěn)定，特征更清晰，便于后續(xù)挑取。
③ 按顯色標準挑取可疑菌落（每平板至少5個，不足全挑），接種于RAYPA制備的TSA平板，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h備用。
3、PCR鑒定
① 從TSA平板挑取2-3個可疑菌落至500μL滅菌去離子水中，混勻后100℃加熱10min，冰浴冷卻，12000r/min離心10min，取上清作為DNA模板。由于RAYPA制備的TSA培養(yǎng)基營養(yǎng)均一，菌落生長狀態(tài)穩(wěn)定，可減少模板提取量的波動。
② 使用 Pipetty 電動移液器連續(xù)分液模式，按表 2 比例精準移取各組分，加入到PCR反應管中，使用電機代替人工操作，可有效避免人為誤差，確保反應體系濃度均一，提升擴增重復性。
 
 
 
③ 設置反應條件，94℃預變性 5min；94℃變性 30s、61℃退火 30s、72℃延伸 30s（35 個循環(huán)）；72℃延伸 5min，4℃保存。
3、每次實驗以克羅諾桿菌標準菌株為陽性對照，大腸埃希氏菌標準菌株為陰性對照，滅菌去離子水分別作為DNA提取空白對照和PCR反應體系空白對照，確保檢測系統(tǒng)有效性。
4、制備1.5%瓊脂糖凝膠，加入核酸染色劑，進行電泳，電壓按電泳槽正負極距離×5V/cm設置，時間20-30min，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。
5、質(zhì)控系統(tǒng)正常，陰性及空白對照無擴增條帶，陽性對照出現(xiàn)282bp條帶時，待測樣品出現(xiàn)282bp條帶為陽性，無則為陰性。
6、從PCR陽性的TSA平板挑取菌落進行生化鑒定。RAYPA儀制備的標準化培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落代謝特征更典型，可提升生化鑒定的準確性，有效排除假陽性。
 
四、結果報告
綜合顯色培養(yǎng)基菌落特征、PCR鑒定結果及生化確證結果，報告100g（mL）樣品中克羅諾桿菌的檢出或未檢出情況。