RAYPA培養(yǎng)基自動制備分裝儀在大腸菌群MPN計數(shù)法中的應用

方案摘要：本方案基于大腸菌群MPN計數(shù)法原理，融合Pipetty電動移液器與RAYPA培養(yǎng)基自動制備分裝儀核心優(yōu)勢，優(yōu)化檢測全流程。RAYPA實現(xiàn)LST、BGLB肉湯的標準化制備、滅菌及定量分裝，保證培養(yǎng)基成分均勻、體積精準，降低污染風險；Pipetty 憑借精準數(shù)字化控量、防殘留設計，高效完成樣品10倍遞增系列稀釋與接種，縮短操作耗時，確保全程符合15分鐘時限要求。兩款儀器協(xié)同，減少人為誤差、強化無菌控制，適配批量檢測需求，最終通過初發(fā)酵、復發(fā)酵篩選陽性管，對照MPN檢索表，精準報告樣品中大腸菌群含量（MPN/g/mL），兼顧檢測準確性與標準化。
 
方案詳情：
一、實驗原理
       大腸菌群MPN計數(shù)法是結合統(tǒng)計學概率與微生物代謝特性的間接計數(shù)法。核心為：將樣品10倍遞增系列稀釋，降低菌濃度至適宜計數(shù)范圍；接種含乳糖的選擇性培養(yǎng)基（如LST、BGLB肉湯），大腸菌群發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，據(jù)此判斷陽性管；選3個連續(xù)稀釋度，記錄各稀釋度陽性管數(shù)；該陽性管組合對應統(tǒng)計學“最可能數(shù)”，對照MPN檢索表即可推算樣品中大腸菌群的估算含量，兼具選擇性與概率代表性。
 
二、‌實驗準備
1、設配和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外,其他設備和材料如下：
① Pipetty 電動移液器；
② 冰箱:2 ℃~8 ℃；
③ 恒溫裝置:48 ℃±2℃；
④ 天平:感量 0.1 g；
⑤ 均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯,振蕩器；
⑥ 試管:15 mmX150 mm、18 mmX180 mm ；
⑦ 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1 ℃、30 ℃±1℃；
⑧ 無菌錐形瓶:容量 500 mL；
⑨ 無菌培養(yǎng)皿:直徑 90 mm；
⑩ pH 計或精密 pH 試紙；
⑪ 無菌接種環(huán):10 μL(直徑約3mm)；
⑫ 自動菌落計數(shù)儀。
 
2、試劑和材料
① 磷酸鹽緩沖液；
② 生理鹽水；
③ 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯；
④ 煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯；
⑤ 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)；
⑥ 1 mol/L NaOH；
⑦ 1 mol/L HCl；
⑧ 大腸菌群計數(shù)測試片。
三、實驗步驟
1、稀釋樣品
① 固體和半固體樣品:無菌操作稱取 25g樣品,放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8 000 r/min~10 000 r/min 均質(zhì)1 min~2 min。
② 液體樣品:用無菌吸管吸取 25 mL樣品置于盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠)中充分混勻。
③ 必要時用1 mol/L, NaOH 或1 mol/L HC1,調(diào)節(jié)樣品勻液或液體樣品原液的 pH 至 6.5~7.5之間。
④ 使用Pipetty電動移液器，裝配無菌吸頭，吸取1:10樣品勻液1mL，沿無菌試管管壁緩緩注入預裝有9mL緩沖液/生理鹽水的無菌試管中（吸頭尖端不觸及稀釋液面）。試管置于振蕩器上振蕩混勻，制成 1:100 勻液；按樣品污染狀況估計，重復上述操作，依次制備10倍遞增系列稀釋液，每遞增稀釋1次，更換1個無菌吸頭。
 
2、初發(fā)酵試驗
① 提前通過RAYPA儀器預設參數(shù)：按LST肉湯配方（單料/雙料）自動完成原料溶解、滅菌、恒溫冷卻，設定分裝體積為 9mL（單料）或對應雙料體積，將無菌試管置于儀器分裝工位，自動定量分裝 LST 肉湯，保證每管培養(yǎng)基成分均勻、體積精準，避免人工分裝的量差與污染風險。
 
② 選擇3個適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可含原液），每個稀釋度對應3管 RAYPA預制的LST肉湯管。
③ 用Pipetty電動移液器，快速吸取1mL樣品勻液接種至每管LST肉湯中；若接種體積超過1mL，直接接種至RAYPA預制的雙料LST肉湯管中。得益于RAYPA預制培養(yǎng)基的提前準備和Pipetty的快速移液，從制備樣品勻液到接種完畢，全程可高效控制在 15 分鐘內(nèi)。
④ 將接種后的 LST 肉湯管置于 36℃±1℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 24h±2h，檢查產(chǎn)氣情況。
⑤ 小倒管（RAYPA 分裝時可同步預置）或產(chǎn)氣收集裝置內(nèi)有氣泡，或振搖后見細密氣泡上升，判為產(chǎn)氣，進入復發(fā)酵試驗；未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至 48h±2h，仍未產(chǎn)氣判為陰性。
若所有LST肉湯管 48h±2h 均未產(chǎn)氣，直接按 MPN 檢索表，報告 MPN/g (mL) 結果。
3、復發(fā)酵試驗
① 通過 RAYPA 培養(yǎng)基自動制備分裝儀，按 BGLB 肉湯配方完成標準化制備、滅菌及定量分裝（每管預設體積），保證所有 BGLB 肉湯管的營養(yǎng)條件一致，避免人工配制導致的批次差異。
 
② 輕輕振搖產(chǎn)氣的 LST 肉湯管，用無菌接種環(huán)取 1 環(huán)培養(yǎng)物，轉種至 RAYPA 預制的 BGLB 肉湯管中。置于 36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h，檢查產(chǎn)氣情況。
③ 產(chǎn)氣判為大腸菌群陽性；未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至 48h±2h，仍未產(chǎn)氣判為陰性。
 
四、結果報告
1、若連續(xù)稀釋度超過 3 個，選擇其中最合適的3個連續(xù)稀釋度。
2、依據(jù)3個適宜連續(xù)稀釋度的大腸菌群陽性管數(shù)，查 MPN 檢索表，以 MPN/g (mL) 表示每克（毫升）樣品的大腸菌群含量，完成報告。