CloudReady生物反應(yīng)器助力高通量實驗快速優(yōu)化硫酸鏈霉素生產(chǎn)工藝

引言
硫酸鏈霉素是一種氨基糖苷類抗生素，具有廣譜的抗菌作用，而灰色鏈霉菌可以天然生物合成硫酸鏈霉素。

本次實驗采用野生型灰色鏈霉菌在4聯(lián)500mL CloudReady云平臺平行生物反應(yīng)器上進(jìn)行了發(fā)酵工藝參數(shù)的快速優(yōu)化。經(jīng)過9天的發(fā)酵培養(yǎng)得出最有培養(yǎng)參數(shù)，即培養(yǎng)溫度30℃，pH 7.2，DO 40%。在此條件下發(fā)酵122h時硫酸鏈霉素效價達(dá)到了10110.14 U/mL，高效的將硫酸鏈霉素的含量提高了2.5倍以上。同時驗證了CloudReady在平行性、高通量、自動化過程控制方面可以為實驗人員提供高效支持，快速進(jìn)行工藝優(yōu)化和菌株篩選。

材料設(shè)備及實驗過程

菌株：
野生灰色鏈霉菌：菌株編號GDMCC 4.19，購自廣東省微生物菌種保藏中心。

設(shè)備：
4聯(lián)CloudReady云平臺生物反應(yīng)器
P1型紫外可見分光光度計

圖1  4聯(lián)CloudReady® 500mL發(fā)酵培養(yǎng)中

工藝參數(shù)和控制策略：
培養(yǎng)過程中以轉(zhuǎn)速持續(xù)下降作為判斷底物營養(yǎng)耗盡的拐點，開啟補料控制。

表2 DO梯度優(yōu)化實驗工藝參數(shù)設(shè)置

圖2 R1-R4罐臺批次生長過程控制DO_AGIT變化曲線

實驗結(jié)果
從四個罐臺的生長曲線可以看出各罐臺硫酸鏈霉素的效價都呈先增加后下降的趨勢。
其中在R3罐臺（DO 40%）呈現(xiàn)了最高的硫酸鏈霉素效價，在發(fā)酵122h有最優(yōu)的硫酸鏈霉素效價為10110.14 U/mL，此時OD600為29.4，濕重為290.4mg/L。
122h后隨著發(fā)酵的進(jìn)行灰色鏈霉菌的細(xì)胞密度OD600雖然還繼續(xù)呈遞增的狀態(tài)，但是硫酸鏈霉素的效價則呈下降趨勢。

圖3 R1-R4罐臺批次生長曲線

圖4 R1-R4罐臺批次濕重趨勢曲線

圖5 R1-R4罐臺批次硫酸鏈霉素效價趨勢曲線

結(jié)論及后續(xù)優(yōu)化方向
本案例通過對灰色鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中不同DO梯度條件的優(yōu)化，得到發(fā)酵過程中控制合適的DO水平（40%）有利于灰色鏈霉菌硫酸鏈霉素的表達(dá)，過高或過低的DO控制水平都會影響灰色鏈霉菌對硫酸鏈霉素的生產(chǎn)表達(dá)。

但是細(xì)胞密度的逐漸增加并不一定有利于硫酸鏈霉素效價的提升，可能原因為培養(yǎng)體系營養(yǎng)物質(zhì)濃度過高，會導(dǎo)致菌體生長過度和菌絲體大量形成，從而延遲了細(xì)胞靜止期的到來，抑制了抗生素的生產(chǎn)。

后期可以通過進(jìn)一步的優(yōu)化發(fā)酵過程中菌株營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、代謝調(diào)控等手段來提升硫酸鏈霉素的效價。

迪必爾應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心 石興利 供稿