RAYPA在食品單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)（MPN計(jì)數(shù)法）中的應(yīng)用

方案摘要：本方案針對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 MPN 法檢測，結(jié)合 RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀優(yōu)化流程。前期通過設(shè)備自動(dòng)化完成稀釋液、單/雙料 FB 增菌肉湯及各類培養(yǎng)基的配制、滅菌與精準(zhǔn)分裝，減少人為誤差與污染風(fēng)險(xiǎn)。檢測流程按樣品勻液制備、系列梯度稀釋、二次增菌培養(yǎng)、分離純化及生化鑒定等步驟開展，依托設(shè)備制備的標(biāo)準(zhǔn)化試劑與培養(yǎng)基，保障菌落生長、生化反應(yīng)環(huán)境一致。方案實(shí)現(xiàn)檢測前期準(zhǔn)備與核心環(huán)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)化、高效化，提升檢測效率與結(jié)果可靠性，適用于批量樣品的規(guī)范化檢測。
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
       本試驗(yàn)基于 MPN 法，結(jié)合單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生物學(xué)特性開展檢測。先將樣品梯度稀釋，降低雜菌干擾；利用 Fraser 增菌肉湯、FB 增菌肉湯的選擇性，富集目標(biāo)菌；通過 OA 顯色培養(yǎng)基等分離純化可疑菌落；再依據(jù)該菌革蘭氏陽性短桿菌形態(tài)、特定動(dòng)力特征、木糖陰性鼠李糖陽性等生化反應(yīng)及狹窄溶血圈等特性鑒定。最后根據(jù)陽性試管數(shù)查 MPN 檢索表，估算樣品中該菌最可能數(shù)。
 
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀；
② Pipetty Pro 非等量電動(dòng)移液器MSIC12-01-1000；
③ 恒溫培養(yǎng)箱:30 ℃±1 ℃、36 ℃±1℃、25 ℃~30 ℃
④ 均質(zhì)器。
⑤ 顯微鏡:100 x~1 000 x。
⑥ 電子天平:感量為 0.1 g、0.1 mg。2.5
⑦ 錐形瓶:100 mL、500 mL。
⑧ 無菌培養(yǎng)皿:直徑 90 mm。
⑨ 無菌試管:16 mm x 160 mm。
⑩ 離心機(jī):4 000 r/min。
⑪ 無菌離心管:30 mm x 100 mm。
⑫ 無菌涂布棒。
⑬ 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC 19111 ；
⑭ 英諾克李斯特氏菌(Listeria innocua)ATCC 33090 ；
⑮ 伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)ATCC 19119；
⑯ 斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeri)ATCC 35967；
⑰ 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923 ；
⑱ 馬紅球菌(Rhodococcus equi)ATCC 6939 ；
⑲ 小鼠:ICR 品系,體重 18 g~22 g。
⑳ 微生物生化鑒定系統(tǒng)及無菌過濾裝置。

2、試劑和材料
① 含 0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)；
② 含 0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)；
③ Fraser 增菌肉湯(FB,、FB,)；
④ OA李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基；
⑤ PALCAM 培養(yǎng)基；
⑥ 革蘭氏染色液；
⑦ SIM 動(dòng)力培養(yǎng)基；
⑧ 緩沖葡萄糖蛋白胨水；
⑨ 羊血瓊脂；
⑩ 無菌磷酸鹽緩沖液；
⑪ 無菌生理鹽水；
⑫ 糖發(fā)酵管；
⑬ 過氧化氫試劑；
⑭ 微生物生化鑒定試劑盒。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、通過 RAYPA 預(yù)設(shè)程序，配制磷酸鹽緩沖液及FB增菌肉湯，設(shè)備自動(dòng)滅菌后，精準(zhǔn)分裝至均質(zhì)袋及無菌試管中，磷酸鹽緩沖液用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min~2 min,制成1:10的樣品勻液。
 
2、用Pipetty電動(dòng)移液器吸取1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于盛有9ml 磷酸鹽緩沖液的無菌試管中,充分混勻。制成1:100的樣品勻液。
 
3、按上述操作程序,制備 10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換1支新吸頭。
4、根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì),選取3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液,使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液功能，每一稀釋度接種3管,接種于 10 mL FB增菌肉湯,每管接種1mL。如果接種量為10 mL,接種至10 ml雙料 FB增菌肉湯。于 30 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h±2 h。每管各吸取 0.1 mL,轉(zhuǎn)種于 10 mL FB,增菌肉湯內(nèi),于 30 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h±2 h。
 
5、用接種環(huán)分別從 FB,增菌肉湯各管中移取1環(huán),接種 OA李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板,36℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h~48 h。
6、從每個(gè)平板中挑取3個(gè)~5 個(gè)典型或可疑菌落(少于3個(gè)全選),在 TSA-YE平板或羊血平板上劃線,于36℃±1 ℃培養(yǎng)18h~24 h。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在 TSA-YE平板或羊血平板上,呈灰白色,半透明,邊緣整齊,露滴狀菌落、直徑為1 mm~2 mm。
7、篩選與鑒定
① 挑取 TSA-YE平板或羊血平板上的單個(gè)菌落,接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管,于36℃±1℃培養(yǎng) 24 h±2 h，同時(shí)在 TSA-YE平板或羊血平板上劃線,于 36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h~24 h,以獲取下一步鑒定用的純培養(yǎng)物。然后選擇木糖陰性,鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。
② 挑取 18 h~24 h純培養(yǎng)的單個(gè)菌落做革蘭氏染色鏡檢,李斯特氏菌為革蘭氏陽性短桿菌,大小為(0.4 μm~0.5 μm)X(0.5 μm~2.0 μm)。用生理鹽水制成菌懸液,在油鏡或相差顯微鏡下觀察該菌出現(xiàn)輕微旋轉(zhuǎn)或翻滾樣的運(yùn)動(dòng)。
③ 挑取 18 h~24h純培養(yǎng)的單菌落穿刺半固體或 SIM 動(dòng)力培養(yǎng)基,于25 ℃~30 ℃培養(yǎng) 48 h±2 h。李斯特氏菌沿穿刺線以不規(guī)則的云霧狀向四周延伸生長,培養(yǎng)基表面下3mm~5 mm處形成一似傘狀(或梭狀)界面。如傘狀(或梭狀)生長不明顯,可繼續(xù)培養(yǎng),每天觀察結(jié)果1次,觀察5 d。
④ 挑取 18 h~24h純培養(yǎng)的單個(gè)菌落,進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn),過氧化氫酶陽性反應(yīng)的菌落繼續(xù)進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、MR-VP試驗(yàn)。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的主要生化特征見表 1。
⑤ 將新鮮的羊血瓊脂平板底面劃分為 20個(gè)~25 個(gè)小格,挑取 18 h~24h純培養(yǎng)的單個(gè)菌落刺種到血平板上,每格刺種1個(gè)菌落,并刺種陽性對照菌和陰性對照菌,穿刺時(shí)盡量接近底部,但不要觸到底面,同時(shí)避免瓊脂破裂,36 ℃±1℃培養(yǎng) 24 h~48 h,于明亮處觀察,單核細(xì)胞增生李斯特氏菌呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周圍產(chǎn)生狹窄、微弱的溶血環(huán),英諾克李斯特氏菌無溶血環(huán),伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的 8-溶血區(qū)域。
 
四、結(jié)果報(bào)告
根據(jù)證實(shí)為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽性的試管管數(shù),査 MPN檢索表,報(bào)告每克(毫升)樣品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的最可能數(shù),以 MPN/g(mL)表示。