RAYPA培養(yǎng)基自動制備分裝儀在大腸菌群MPN計數(shù)法的應(yīng)用

方案摘要：本方案依托 RAYPA 培養(yǎng)基自動制備分裝儀的自動制備、滅菌、精準(zhǔn)分裝的優(yōu)勢，及 Pipetty 電動移液器精度高、可連續(xù)分液、重復(fù)性強(qiáng)的特點，在符合檢測標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，簡化操作步驟、減少人為誤差，提升檢測效率與結(jié)果穩(wěn)定性。
 
方案詳情：
一、實驗原理
       基于大腸菌群生化特性（發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣）篩選與統(tǒng)計學(xué)概率估算結(jié)合。大腸菌群為革蘭氏陰性菌，初發(fā)酵用 LST 肉湯抑制革蘭氏陽性菌，其發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣者判為疑似陽性；復(fù)發(fā)酵用 BGLB 肉湯排除假陽性，確保特異性。樣品經(jīng) 10 倍遞增稀釋后，選 3 個連續(xù)稀釋度各接種 3 管，通過陽性管數(shù)反映菌量分布。基于泊松分布原理，對照 MPN 檢索表得出 “最可能數(shù)”，解決菌群分布不均的計數(shù)難題，實現(xiàn)定量估算。
 
二、‌實驗準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：
① RAYPA培養(yǎng)基自動制備分裝儀;
② Pipetty 電動移液器MSIC01-03-1000;
③ 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1 ℃、30 ℃±1℃;
④ 冰箱:2 ℃~8 ℃;
⑤ 恒溫裝置:48 ℃±2 ℃;
⑥ 天平:感量 0.1 g;
⑦ 均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯,振蕩器;
⑧ 試管:15 mm×150 mm、18 mm×180 mm；
⑨ 無菌錐形瓶:容量 500 mL;
⑩ 無菌培養(yǎng)皿:直徑 90 mm;
⑪ pH 計或精密 pH 試紙;
⑫ 無菌接種環(huán):10 μL(直徑約3 mm);
⑬ 自動菌落計數(shù)儀。

2、試劑和材料
① 磷酸鹽緩沖液；
② 生理鹽水；
③ 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯；
④ 煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯；
⑤ 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)；
⑥ 1 mol/L NaOH；
⑦ 1 mol/L HCl；
⑧ 大腸菌群計數(shù)測試片。
 
三、實驗步驟
1、樣品稀釋
① 固體和半固體樣品:無菌操作稱取 25g樣品,放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000 r/min~10000 r/min 均質(zhì)1 min~2 min，制成 1:10 的樣品勻液。
② 液體樣品:用無菌吸管吸取 25 mL樣品置于盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中充分混勻,制成1:10 的樣品勻液。
③ 必要時用1 mol/l NaOH 或1 mol/L HC1,調(diào)節(jié)樣品勻液或液體樣品原液的pH至 6.5~7.5之間。
④ 用Pipetty電動移液器吸取1mL的1:10 樣品勻液，沿管壁緩緩注入裝有9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),將試管在振蕩器上振蕩混勻,制成1:100 的樣品勻液。
 
⑤ 根據(jù)對樣品污染狀況的估計,參照上述稀釋操作,依次制成 10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支無菌吸管或吸頭。全程依托電動移液器的精準(zhǔn)定量功能，避免手工吸液的誤差。
2、初發(fā)酵試驗
① 提前通過 RAYPA 培養(yǎng)基自動制備分裝儀設(shè)置參數(shù)配制 LST 肉湯， 設(shè)定分裝體積（單料 LST 肉湯每管 10mL，雙料 LST 肉湯每管 20mL）；自動滅菌后，將培養(yǎng)基分裝至無菌試管中，分裝后試管自動冷卻至室溫備用。
 
② 根據(jù)樣品污染狀況估計，選擇 3 個適宜連續(xù)稀釋度（液體樣品可含原液），每個稀釋度對應(yīng) 3 管 LST 肉湯。使用 Pipetty 電動移液器，無菌吸取各稀釋度樣品勻液 1mL，快速注入對應(yīng) LST 肉湯管中，吸頭一次性使用，避免交叉污染。
③ 將接種后的 LST 肉湯管置于 36℃±1℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 24h±2h，觀察小倒管或產(chǎn)氣收集裝置的氣泡產(chǎn)生情況（輕輕振搖試管，若有細(xì)密氣泡持續(xù)上升即為產(chǎn)氣）。產(chǎn)氣者直接進(jìn)入復(fù)發(fā)酵試驗；未產(chǎn)氣者繼續(xù)培養(yǎng)至 48h±2h，若產(chǎn)氣則轉(zhuǎn)入復(fù)發(fā)酵，仍未產(chǎn)氣判定為大腸菌群陰性。若 48h±2h 內(nèi)所有 LST 肉湯管均未產(chǎn)氣，直接參照MPN 檢索表，報告每克（毫升）樣品的 MPN 值。
3、復(fù)發(fā)酵試驗
① 通過 RAYPA 培養(yǎng)基自動制備分裝儀配制 BGLB 肉湯，設(shè)定分裝體積為 10mL / 管，啟用 “滅菌 - 分裝” 模式，滅菌后冷卻備用，RAYPA 可保證每管 BGLB 肉湯濃度一致、無菌性達(dá)標(biāo)。
 
② 輕輕振搖所有產(chǎn)氣的 LST 肉湯管，用無菌接種環(huán)取 1 環(huán)培養(yǎng)物，精準(zhǔn)轉(zhuǎn)種至預(yù)置的 BGLB 肉湯管中，Pipetty 可輔助吸取少量培養(yǎng)物用于微量轉(zhuǎn)種，提升操作便捷性。
③ 將 BGLB 肉湯管置于 36℃±1℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 24h±2h，觀察產(chǎn)氣情況：產(chǎn)氣者判定為大腸菌群陽性；未產(chǎn)氣者繼續(xù)培養(yǎng)至 48h±2h，若產(chǎn)氣仍為陽性，始終未產(chǎn)氣則為陰性。
四、結(jié)果報告
根據(jù)復(fù)發(fā)酵試驗中3個適宜連續(xù)稀釋度中大腸菌群陽性的管數(shù),按照 MPN 檢索表,報告每克(毫升)樣品中大腸菌群的MPN 值,以 MPN/g(mL)表示。