實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)造模誘導(dǎo)方法及核心試劑的優(yōu)勢(shì)和作用

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE）是研究多發(fā)性硬化（MS）的金標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型，通過模擬自身免疫性T細(xì)胞攻擊中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS），再現(xiàn)MS的神經(jīng)炎癥、脫髓鞘及神經(jīng)功能障礙等核心病理特征。EAE模型在MS發(fā)病機(jī)制研究、神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)藥物篩選（如Roflumilast）、髓鞘修復(fù)與神經(jīng)保護(hù)療法開發(fā)等研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

愛必信憑借專業(yè)的研發(fā)實(shí)力和嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系，精心打造了高穩(wěn)定性、高重復(fù)性的EAE模型研究全套試劑組合，造模核心試劑優(yōu)勢(shì)如下：
✅ 現(xiàn)貨速發(fā)：百日咳毒素國(guó)內(nèi)現(xiàn)貨、極高純度（>99%）、高品質(zhì)、高性價(jià)比
✅ 高發(fā)病率：C57BL/6小鼠免疫后10-14天穩(wěn)定發(fā)病（臨床評(píng)分2-4分）
✅ 病理重現(xiàn)性好：明確髓鞘脫失（LFB染色）& Th17細(xì)胞浸潤(rùn)（流式驗(yàn)證）
✅ 多維評(píng)價(jià)體系：支持臨床評(píng)分、行為學(xué)、組織病理學(xué)、分子生物學(xué)全維度驗(yàn)證

1. EAE模型核心試劑

（2）佐劑
完全弗氏佐劑（CFA, Complete Freund’s Adjuvant）
成分：礦物油 + 滅活結(jié)核分枝桿菌（如 Mycobacterium tuberculosis H37Ra，濃度 4-5 mg/mL）
作用：增強(qiáng)免疫應(yīng)答，與MOG₃₅₋₅₅乳化后使用

（3）免疫增強(qiáng)劑
百日咳毒素（Pertussis Toxin, PTX）
劑量： 200-500 ng/只小鼠（腹腔注射）
注射時(shí)間：免疫當(dāng)天（Day 0）及第2天（Day 2）
作用：破壞血腦屏障，促進(jìn)T細(xì)胞浸潤(rùn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)

2. EAE模型誘導(dǎo)方法
（1）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：通常選擇6 - 8周齡的雌性C57BL/6小鼠或Sprague-Dawley大鼠。
動(dòng)物數(shù)量：根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組至少需要10只動(dòng)物以確保統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
動(dòng)物適應(yīng)：將動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)1周，保持溫度、濕度和光照條件穩(wěn)定。試劑準(zhǔn)備：將
MOG_35-55肽溶解于生理鹽水中，與等體積的CFA混合乳化，形成均勻的乳劑。

（2）EAE誘導(dǎo)
第0天：
乳劑制備：將300 µg MOG_35-55肽與300 µL CFA混合乳化。
注射：將乳劑分兩次（每側(cè)100 µL）皮下注射于小鼠雙側(cè)腋窩、腹股溝和背部。
PTX注射：腹腔注射200 ng PTX。
第2天：
再次注射PTX：腹腔注射200 ng PTX。

3. EAE模型驗(yàn)證
EAE模型的驗(yàn)證需通過臨床評(píng)估、行為學(xué)、組織病理學(xué)、分子生物學(xué)等多維度進(jìn)行，以下是系統(tǒng)的驗(yàn)證方法分類及操作要點(diǎn)。

（1）臨床評(píng)分驗(yàn)證
①標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)分系統(tǒng)0-5分量表（最常用）：從第0天開始，連續(xù)觀察30天或更長(zhǎng)時(shí)間。
評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無癥狀。1分：尾部無力或癱瘓。2分：后肢無力。3分：后肢癱瘓。4分：四肢癱瘓。5分：死亡。

②體重監(jiān)測(cè)：EAE小鼠通常伴隨體重下降（>10%提示模型成功），需每日記錄，體重持續(xù)下降可能需倫理干預(yù)。

（2）行為學(xué)檢測(cè)
①運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估
轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)（Rotarod）：加速模式（4-40 rpm，5min內(nèi)完成）記錄跌落時(shí)間，反映協(xié)調(diào)性與耐力。
步態(tài)分析（CatWalk或足印法）：量化步幅長(zhǎng)度、基寬、擺動(dòng)速度。

②抑郁樣行為檢測(cè)
強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（FST）：記錄不動(dòng)時(shí)間（反映絕望行為）。
懸尾實(shí)驗(yàn)（TST）：輔助驗(yàn)證抑郁表型。

（3）組織病理學(xué)驗(yàn)證
①取材與處理
灌注固定：4%多聚甲醛灌注后取脊髓（腰膨大段）和腦組織。
切片制備：石蠟切片（5μm）或冷凍切片（10μm）。

②染色方法

（4）分子生物學(xué)驗(yàn)證
①流式細(xì)胞術(shù)
細(xì)胞亞群分析：Th1（CD4+IFN-γ+）、Th17（CD4+IL-17+）、Treg（CD4+FoxP3+）。
樣本來源：脾臟、淋巴結(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)單細(xì)胞懸液。

②細(xì)胞因子檢測(cè)
ELISA/液相芯片：促炎因子：TNF-α、IL-6、IL-17
抗炎因子：IL-10、TGF-β
qPCR：脊髓/腦組織中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)。

③蛋白表達(dá)分析
Western Blot：
炎癥通路蛋白：NF-κB p65、pSTAT3
神經(jīng)保護(hù)標(biāo)志物：BDNF、NGF

4. 模型成功標(biāo)準(zhǔn)
基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)病率>80%（臨床評(píng)分≥2）；病理確認(rèn)HE顯示炎性浸潤(rùn)+ LFB證實(shí)髓鞘脫失。
高級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：行為學(xué)異常（Rotarod時(shí)間↓50%）；分子標(biāo)志物：Th17比例↑2倍，CNS中IL-17水平顯著升高。

6. 特色應(yīng)用案例
東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)精神病學(xué)研究所附屬中大醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科張志珺教授團(tuán)隊(duì)采用實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠模型，研究Roflumilast的作用。他們的研究表明Roflumilast有可能成為改善MS抑郁癥狀和急性時(shí)相運(yùn)動(dòng)障礙的潛在藥物，其抗炎、減炎和抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的特性提示其在MS治療中的潛力。IL6、IL1B和TNF是MS和抑郁癥共有的關(guān)鍵基因，其編碼的細(xì)胞因子存在蛋白質(zhì)相互作用。IL-6可能在多發(fā)性硬化癥相關(guān)抑郁中發(fā)揮重要作用，IL-6拮抗劑可能成為改善多發(fā)性硬化癥抑郁的潛在治療策略。研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明MS和抑郁癥的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索^[1]。

參考文獻(xiàn)：
[1] Wang Z, Zhang Y, Chai J, Wu Y, Zhang W, Zhang Z. Roflumilast: Modulating neuroinflammation and improving motor function and depressive symptoms in multiple sclerosis[J]. J Affect Disord. 2024;350:761-773. doi:10.1016/j.jad.2023.12.074

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