RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀在克羅諾桿菌定量檢驗(yàn)中的應(yīng)用

方案摘要：本方案基于MPN法原理開(kāi)展克羅諾桿菌定量檢驗(yàn)，核心引入RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀優(yōu)化流程。該儀器以一體化滅菌、精準(zhǔn)控溫及定量分裝優(yōu)勢(shì)，制備厚度均一的顯色培養(yǎng)基平板，降低污染風(fēng)險(xiǎn)與人為誤差。實(shí)驗(yàn)通過(guò)BPW前增菌、mLST-Vm選擇性增菌后，用儀器制備的顯色培養(yǎng)基分離可疑菌落，經(jīng)TSA純化及生化鑒定確證。依據(jù)陽(yáng)性管數(shù)查MPN檢索表，報(bào)告100g(mL)樣品MPN值。RAYPA儀器實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基制備標(biāo)準(zhǔn)化，較傳統(tǒng)方式效率大大提升，同時(shí)提升無(wú)菌性與均一性，為檢驗(yàn)結(jié)果精準(zhǔn)性提供核心保障。
 
方案詳情：

• 實(shí)驗(yàn)原理

克羅諾桿菌定量檢驗(yàn)基于 MPN（最大可能數(shù)）法原理，結(jié)合選擇性增菌、特異性分離及精準(zhǔn)鑒定實(shí)現(xiàn)定量。先以 BPW 培養(yǎng)基前增菌，為少量目標(biāo)菌提供生長(zhǎng)環(huán)境；再用 mLST-Vm 選擇性培養(yǎng)基抑制雜菌、富集目標(biāo)菌。借助顯色培養(yǎng)基分離可疑菌落，挑取后經(jīng) TSA 純化，通過(guò)生化反應(yīng)驗(yàn)證典型特征，可選 PCR 靶向 ITS 區(qū)域確認(rèn)。最終依據(jù)不同稀釋度陽(yáng)性管數(shù)查 MPN 檢索表，報(bào)告 100g (mL) 樣品中目標(biāo)菌 MPN 值。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty 電動(dòng)移液器；
② 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃士1 ℃,41.5 ℃±1℃；
③ 冰箱:2 ℃~5 ℃,-20 ℃；
④ 恒溫水浴箱:41.5 ℃±1℃；
⑤ 天平:感量 0.1g、0.01g；
⑥ 振蕩器；
⑦ 無(wú)菌容器:容量 100mL、200mL、2000 mL；
⑧ 無(wú)菌培養(yǎng)皿:直徑90mm；
⑨ pH 計(jì)或 pH 比色管或精密 pH 試紙；
⑩ 微生物生化鑒定系統(tǒng)；
⑪ PCR儀；
⑫ 離心機(jī):轉(zhuǎn)速≥12000r/min；
⑬ 凝膠成像系統(tǒng)或紫外檢測(cè)儀；
⑭ 瓊脂糖水平電泳儀或毛細(xì)管電泳儀；
⑮ PCR反應(yīng)管；
⑯ RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀；
 
2、試劑和材料
① 緩沖蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)；
② 改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycinmedium,mLST-Vm)；
③ 克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基；
④ 胰蛋白胨大豆瓊脂(trypticase soy agar,TSA)；
⑤ 生化鑒定試劑盒；
⑥ 氧化酶試劑；
⑦ L-賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基；
⑧ L-鳥(niǎo)氨酸脫羧酶培養(yǎng)基；
⑨ L-精氨酸雙水解酶培養(yǎng)基；
⑩ 糖類(lèi)發(fā)酵培養(yǎng)基；
⑪ 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基；
⑫ 克羅諾桿菌質(zhì)控菌株；
⑬ 大腸埃希氏菌質(zhì)控菌株；
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、取檢樣100g(mL)、10g(mL)、1g(mL)各3份，分別置于2000mL、200mL、100mL無(wú)菌容器中，對(duì)應(yīng)加入900mL、90mL、9mL已通過(guò)恒溫水浴箱預(yù)熱至41℃±1℃的BPW培養(yǎng)基。將容器置于振蕩器上輕柔振蕩5~10min，確保檢樣充分溶解并與培養(yǎng)基混勻，制成1:10樣品勻液。將上述勻液置于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h±2h，完成前增菌。前增菌結(jié)束后，輕柔搖動(dòng)容器使培養(yǎng)物混勻，用無(wú)菌1mL移液管精準(zhǔn)吸取1mL前增菌液，轉(zhuǎn)入含10mL mLST-Vm肉湯的無(wú)菌容器中，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行管。將所有接種后的mLST-Vm肉湯容器置于41.5℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h，完成選擇性增菌。
 
2、分離培養(yǎng)
① 提前啟動(dòng)RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀，按照克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基配方加入干粉培養(yǎng)基與適量無(wú)菌水，儀器自動(dòng)完成加熱融化及滅菌。待培養(yǎng)基滅菌后，儀器自動(dòng)冷卻至45℃以下并精準(zhǔn)分裝至無(wú)菌培養(yǎng)皿中，分裝完成后自然凝固備用。此過(guò)程全程密閉操作，有效減少人工干預(yù)導(dǎo)致的污染風(fēng)險(xiǎn)，且每皿培養(yǎng)基體積、厚度均一，保障后續(xù)菌落生長(zhǎng)的一致性�；靹騧LST-Vm肉湯培養(yǎng)物，用Pipetty電動(dòng)移液器精準(zhǔn)吸取10μL培養(yǎng)物，分別在2個(gè)提前制備好的克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線接種。接種完成后，將平板倒置放入36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h。
 
② 菌落純化：根據(jù)克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基的判定標(biāo)準(zhǔn)（如特定顏色、形態(tài)菌落）挑取可疑菌落，每個(gè)平板至少挑取5個(gè)（若不足5個(gè)則全部挑�。�。使用無(wú)菌接種環(huán)挑取可疑菌落，分別劃線接種于TSA平板上，置于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h，獲得純化菌落備用。
3、選取TSA平板上純化后的菌落進(jìn)行生化鑒定，優(yōu)先選取克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基上最具典型特征菌落對(duì)應(yīng)的純化菌落。用無(wú)菌接種環(huán)挑取新鮮傳代的純化菌落，按照微生物生化鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū)及關(guān)鍵生化指標(biāo)檢測(cè)要求，依次進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)、脫羧酶試驗(yàn)、糖類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn)及西蒙氏檸檬酸鹽試驗(yàn)等。若首個(gè)典型菌落生化鑒定為陽(yáng)性，則可判定該樣品檢出克羅諾桿菌，無(wú)需進(jìn)一步鑒定其他菌落；若首個(gè)菌落為陰性，則依次選取其他純化菌落進(jìn)行鑒定，直至所有挑取菌落均為陰性（判定未檢出）或出現(xiàn)陽(yáng)性菌落（判定檢出）。對(duì)于需精準(zhǔn)溯源的場(chǎng)景，可選取陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR靶向ITS區(qū)域檢測(cè)，進(jìn)一步確認(rèn)菌株身份。克羅諾桿菌的主要生化特征見(jiàn)表3。
 
四、結(jié)果報(bào)告
綜合克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基上的菌落特征及生化確證試驗(yàn)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)各稀釋度對(duì)應(yīng)的mLST-Vm選擇性增菌陽(yáng)性管數(shù)。根據(jù)陽(yáng)性管數(shù)查閱MPN檢索表，計(jì)算并報(bào)告100g(mL)樣品中克羅諾桿菌的MPN值。若所有稀釋度均未檢出陽(yáng)性管，報(bào)告為“克羅諾桿菌未檢出”。