CD45/CD8腫瘤細(xì)胞磁珠分選的優(yōu)勢(shì)及操作步驟

腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（Tumor-infiltrating lymphocyte，TILs），是指從腫瘤組織內(nèi)部或腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)、遷移而來(lái)的一類免疫細(xì)胞，核心功能是識(shí)別并攻擊腫瘤細(xì)胞，是機(jī)體對(duì)抗腫瘤的關(guān)鍵 “免疫防線” 之一[1]。然而，腫瘤細(xì)胞中的TIL亞群的細(xì)胞數(shù)量非常低，很容易在分離時(shí)丟失。因此，高效分離TIL 細(xì)胞及其亞群進(jìn)行細(xì)胞研究和臨床治療非常重要。

腫瘤微環(huán)境組成示意圖[2]

美天旎針對(duì)腫瘤樣本細(xì)胞異質(zhì)性高、雜質(zhì)干擾多、TIL 含量低且易損等痛點(diǎn)，專門研發(fā) TIL分選磁珠。通過(guò)精準(zhǔn)靶向 TIL 表面標(biāo)志物及優(yōu)化結(jié)合工藝，高效規(guī)避非特異性結(jié)合，提升分選回收率與純度，為后續(xù)研究和免疫治療提供高質(zhì)量起始細(xì)胞。

美天旎TIL分選磁珠的優(yōu)勢(shì)：
● 靶向準(zhǔn)純度高：例如以 CD45 為特異性靶點(diǎn)，磁珠精準(zhǔn)綁定 TIL，配合 MACS® 技術(shù)獲 90%+ 純度 CD45+ TIL，還可聯(lián)用磁珠去紅細(xì)胞，排除非免疫細(xì)胞

● 毒性低活性強(qiáng)：50nm 磁珠溫和結(jié)合無(wú)損傷，分選無(wú)需離心避免應(yīng)激，最大保留 TIL 殺瘤功能與擴(kuò)增潛力，適配科研測(cè)序與臨床回輸

● 通量高效率優(yōu)：?jiǎn)闻�處理達(dá) 1×10⁹細(xì)胞，超傳統(tǒng)方法；流程標(biāo)準(zhǔn)化，配自動(dòng)化設(shè)備提速，適配高通量科研與臨床批量生產(chǎn)

本文將詳細(xì)解析美天旎磁珠分選實(shí)驗(yàn)前后的關(guān)鍵注意事項(xiàng)，并深入解讀三款熱門TIL細(xì)胞磁珠分選實(shí)驗(yàn)流程（CD45、CD8），涉及陽(yáng)性分選策略。助您一站式掌握腫瘤細(xì)胞磁珠分選核心技術(shù)！

關(guān)于磁珠分選實(shí)驗(yàn)，您務(wù)必要知道的關(guān)鍵點(diǎn)（耐心看完，后附分選實(shí)操案例）
分選前準(zhǔn)備
❖ 確認(rèn)磁珠：根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)種屬、樣本來(lái)源、目的細(xì)胞marker選擇適配的磁珠。
❖ 確認(rèn)分選策略： 根據(jù)您實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)類型以及后續(xù)需求選擇對(duì)應(yīng)的分選策略。

陽(yáng)性分選
目的細(xì)胞被磁性標(biāo)記后，作為陽(yáng)性標(biāo)記組分直接分選出來(lái)。該方法常用于以下情況：
1. 分選表達(dá)單一表面標(biāo)志物的細(xì)胞分選（如CD3+,CD4+,CD8+細(xì)胞）
2. 稀有細(xì)胞的分選 (如循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞TIL)
3. 表達(dá)較弱的表面標(biāo)志物細(xì)胞分選（如CD133+細(xì)胞）
4. 去除特定細(xì)胞群分選（如TCRαβ+T去除、CD45RA+細(xì)胞去除）

陰性分選/去除分選
非目的細(xì)胞磁性標(biāo)記后從細(xì)胞混合物中去除，即未磁性標(biāo)記的細(xì)胞為目的細(xì)胞。該方法常用于以下情況：
1. 去除特定非目的細(xì)胞群
2. 缺乏目的細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物的分選（如某些腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)元）
3. 磁珠分選后需進(jìn)一步通過(guò)陽(yáng)性選擇分選細(xì)胞亞群（CD4+CD25+Treg）
4. 分選后的細(xì)胞表面不可帶有任何磁珠標(biāo)記

順序分選
聯(lián)合使用兩種分選策略，例如先陰選后陽(yáng)選，或先使用可剪切的REAlease磁珠后進(jìn)行陽(yáng)性分選。該方法常用于以下情況：
1. 同步分離兩種特定細(xì)胞亞群：首先通過(guò)陰性分選去除共同雜質(zhì)細(xì)胞，隨后利用陽(yáng)性分選將剩余的目標(biāo)細(xì)胞亞群分開(kāi)
2. 目標(biāo)抗原在非目的細(xì)胞上存在交叉表達(dá)，導(dǎo)致直接陽(yáng)性分選純度不足
3. 要分選極稀有的細(xì)胞，通過(guò)預(yù)富集步驟提高目的細(xì)胞的純度和得率

全血分選
從血液樣本中直接分選目的細(xì)胞，無(wú)需裂解紅細(xì)胞，無(wú)需密度梯度離心。該方法常用于以下情況：
1. 簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程，省去離心等操作步驟，短時(shí)間內(nèi)獲得高回收率，高活性的目的細(xì)胞
2. 針對(duì)血樣樣本量較少，可最大程度上節(jié)省樣本的損失
❖ 確認(rèn)分選柱：對(duì)于不同類型的分選柱選擇，關(guān)鍵是不要超過(guò)推薦的細(xì)胞量，否則會(huì)使柱子過(guò)載，導(dǎo)致分選效果不佳�？筛鶕�(jù)您的細(xì)胞總數(shù)和目標(biāo)細(xì)胞數(shù)、分選策略選擇對(duì)應(yīng)的分選柱，可參考下圖。對(duì)于具體使用的磁珠，參考每個(gè)磁珠說(shuō)明書(shū)附的數(shù)據(jù)表，進(jìn)行分選柱的選擇。

注：全血分選磁珠需搭配全血分選柱套裝（# 130-093-545），其中包含全血分選柱和全血分選緩沖液。

相關(guān)產(chǎn)品貨號(hào)：

貨號(hào)	名稱	規(guī)格	總細(xì)胞上限數(shù)目	標(biāo)記細(xì)胞上限數(shù)目
130-042-201	MS Columns	25根/盒	2x108	107
130-122-727	MS Columns plus tubes	25根+75支
130-042-401	LS Columns	25根/盒	2x109	108
130-122-729	LS Columns plus tubes	25根+75支
130-042-901	LD Columns	25根	5x108	108

相關(guān)產(chǎn)品貨號(hào)：

分選柱	分選套裝名稱	貨號(hào)	通道	分選套裝名稱
MS	MiniMACS Starting kit	130-090-312	單通道	陽(yáng)性分選
	OctoMACS Starting Kit	130-042-108	多通道
LS/LD	MidiMACS Starting kit	130-042-301	單通道	陽(yáng)性分選、陰性分選
	QuadroMACS Starting kit	130-091-051	多通道
MS/LS.LD	Mini&midiMACS Starting Kit	130-042-501	單通道*2	陽(yáng)性分選、陰性分選

注：全血分選柱可搭配Midi MACS分選器（#130-042-302）或 QuadroMACS  Separator分選器 (# 130-090-976)

❖ 準(zhǔn)備分選緩沖液：
方案1：將MACS BSA Stock Solution（#130-091-376）和autoMACS Rinsing Solution（#130-091-222）按照1:20配置，作為分選buffer；分選緩沖液需放置4°預(yù)冷。

方案2：如您的細(xì)胞對(duì)于疊氮化鈉成分不敏感，可直接選擇autoMACS Running Buffer（#130-091-221）進(jìn)行分選。該buffer內(nèi)含有少量的疊氮化鈉，對(duì)某些敏感細(xì)胞，例如神經(jīng)細(xì)胞造成影響。

方案3：含0.5%BSA(abs9156-50g)、2mM EDTA(abs9133)的PBS(abs962)，配置后調(diào)整PH至7.2，需去除氣泡，氣泡可能導(dǎo)致分選柱堵塞。配好的buffer可先靜置，也可使用真空抽濾、超聲消除氣泡。

❖ 細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性檢測(cè)：
分選前需要檢測(cè)單細(xì)胞樣本的細(xì)胞量及細(xì)胞活率，通過(guò)細(xì)胞量計(jì)算您的磁珠添加量；建議起始單細(xì)胞活率達(dá)到85%以上再進(jìn)行磁珠分選，會(huì)得到較為理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

您可以選擇對(duì)應(yīng)產(chǎn)品提升樣本的初始活性：

細(xì)胞篩網(wǎng)：利用細(xì)胞篩網(wǎng)將粗提的單細(xì)胞懸液過(guò)篩，過(guò)濾組織團(tuán)塊，可根據(jù)您的細(xì)胞大小選擇合適孔徑的篩網(wǎng)（MACS® SmartStrainers70μm#130-098-462或70um細(xì)胞篩網(wǎng)#abs7232）

碎片去除試劑：利用密度梯度離心的原理去除碎片（Debris Removal Solution#130-109-398或細(xì)胞分離液#abs9102）、

死細(xì)胞去除磁珠：磁珠標(biāo)記死細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸，通過(guò)高強(qiáng)度磁場(chǎng)，將死細(xì)胞去除（ Dead Cell Removal Kit #130-090-101）、

裂紅試劑：利用細(xì)胞內(nèi)外存在鹽離子濃度差而導(dǎo)致細(xì)胞膜脹破的原理來(lái)裂解無(wú)核紅細(xì)胞。（Red Blood Cell Lysis Solution (10×)#130-094-183或紅細(xì)胞裂解液（1×）#abs9101）

分選過(guò)程中：
一、磁珠篇：
❖ 美天旎磁珠為膠體溶液，不會(huì)沉淀，實(shí)驗(yàn)前不用搖晃即可直接使用。
❖ 磁珠說(shuō)明書(shū)中推薦的磁珠標(biāo)記的體積適用于1×10⁷的細(xì)胞。當(dāng)您的總細(xì)胞量少于10⁷細(xì)胞，需按照說(shuō)明使用相同的體積。當(dāng)超過(guò)10⁷細(xì)胞數(shù)，將所有試劑體積和總體積按照相應(yīng)比例增加。
❖ 磁珠孵育溫度根據(jù)說(shuō)明書(shū)通常為2-8℃，建議在冰箱中避光孵育，直接放置于冰上會(huì)使磁珠結(jié)合效率變差。提高溫度或延長(zhǎng)孵育時(shí)間均可能導(dǎo)致非特異性磁性標(biāo)記。如磁珠說(shuō)明書(shū)中推薦孵育時(shí)間為（+19-25℃），則磁珠應(yīng)在室溫條件下避光孵育。

二、分選篇：
❖ 分選柱在加樣前需使用緩沖液潤(rùn)洗，潤(rùn)洗分選柱的緩沖液請(qǐng)事先回溫至操作環(huán)境溫度，防止預(yù)冷的緩沖液潤(rùn)洗室溫分選柱，導(dǎo)致分選柱中形成小氣泡，使分選效果不佳。
❖ 整個(gè)分選過(guò)程要盡量快速操作，保持細(xì)胞處于低溫，分選過(guò)程中使用的分選緩沖液需預(yù)冷，可防止抗體包裹在細(xì)胞表面以及非特異性的磁性標(biāo)記。
❖ 每一次向分選柱中加液均需等到分選柱中的液體流空，最后一滴在分選柱中不滴出時(shí)，再進(jìn)行下一步加液。
❖ 收集分選柱中磁珠標(biāo)記的細(xì)胞液，需要將分選柱從磁場(chǎng)中拿下，放至收集管上，向分選柱加入緩沖液后立即進(jìn)行栓塞按壓；分選柱栓塞只能按壓一次，請(qǐng)勿反復(fù)操作。
❖ 分選柱為一次性耗材，請(qǐng)勿重復(fù)使用。

分選結(jié)束后：
❖ 利用流式檢測(cè)目的細(xì)胞占比及分選后細(xì)胞活性，計(jì)算出分選純度和分選得率，您可參考以下公式進(jìn)行計(jì)算：
· 分選純度=分選后目的細(xì)胞總數(shù)量/分選后所得所有細(xì)胞總數(shù)量
· 分選得率=分選后目的細(xì)胞總數(shù)量/分選前目的細(xì)胞總數(shù)量
注意：分選前目的細(xì)胞總數(shù)量=標(biāo)記后未上柱子前的細(xì)胞懸液*目的細(xì)胞占比

為您詳細(xì)解讀3款熱門細(xì)胞分選實(shí)例，干貨來(lái)襲，照搬流程直接做實(shí)驗(yàn)！

陽(yáng)性分選：
CD45 (TIL) MicroBeads, mouse（#130-110-618）
CD45 (TIL) MicroBeads, human（#130-118-780）
CD8 (TIL) MicroBeads, mouse（# 130-116-478）

陽(yáng)性分選：CD45 (TIL) MicroBeads, mouse（#130-110-618）

磁性分選耗材
❖ MS分選柱（#130-042-201）或LS分選柱（#130-042-401）
❖ MS分選柱對(duì)應(yīng)的Mini MACS分選器（#130-042-102）或OctoMACS分選器（#130-042-109）；
❖ LS分選柱對(duì)應(yīng)的Midi MACS分選器（#130-042-302）或QuadroMACS分選器（#130-090-976）；
❖ MACS MultiStand（#130-042-303）
❖ MACS BSA Stock Solution（#130-091-376）和autoMACS Rinsing Solution（#130-091-222）1:20配置
❖ Pre-Separation Filters 30μm預(yù)分離濾器（#130-041-407）（可選，磁珠標(biāo)記前去除細(xì)胞團(tuán)，防止堵塞分選柱）

實(shí)驗(yàn)步驟
一、磁珠標(biāo)記CD45細(xì)胞
1.細(xì)胞計(jì)數(shù)；
2.細(xì)胞懸液300×g離心10分鐘，棄上清；
3.細(xì)胞重懸，每1×10⁷細(xì)胞添加80μL分選緩沖液；
4.每1×10⁷細(xì)胞添加20 μLCD56 MicroBeads磁珠；
5.混勻，于2-8℃孵育15min；
6.（可選）添加熒光染色抗體
7.添加分選緩沖液，調(diào)整溶液體積至500 μL（注：500 μL體積最大重懸至5×10⁷細(xì)胞，對(duì)于對(duì)于更多的細(xì)胞數(shù)量，需要相應(yīng)提高緩沖液體積）

二、磁珠分選CD45細(xì)胞
1. 將分選柱放入對(duì)應(yīng)的MACS分選器的磁場(chǎng)中，如需詳細(xì)分選柱信息請(qǐng)查看MACS分選柱載量數(shù)據(jù)表；
2. 用適量緩沖液潤(rùn)洗分選柱，等到分選柱中液體排空后，再進(jìn)行下一步驟（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液潤(rùn)洗；LS分選柱使用3 mL分選緩沖液潤(rùn)洗）；
3. 將制備好的細(xì)胞懸液加入分選柱中，收集的流穿細(xì)胞液為未被標(biāo)記的細(xì)胞；
4. 分別用分選緩沖液清洗柱子三次（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液清洗3次；LS分選柱使用1 mL分選緩沖液清洗2次），收集未被標(biāo)記的非CD45細(xì)胞；
5. 從分選器中取出分選柱，將其放到合適的收集管上；
6. 吸取適量的緩沖液（MS：1 mL；LS：3 mL），加到分選柱中，立即將栓塞推入分選柱中，沖洗出磁珠標(biāo)記的細(xì)胞，即為CD45細(xì)胞；
7. （可選）若需提高 CD45⁺細(xì)胞純度，可將洗脫組分用新的 MS 或 LS 柱子重復(fù)步驟 1-6 再次分選。

陽(yáng)性分選： CD45 (TIL) MicroBeads, human（#130-118-780）

磁性分選耗材
❖ MS分選柱（#130-042-201）或LS分選柱（#130-042-401）
❖ MS分選柱對(duì)應(yīng)的Mini MACS分選器（#130-042-102）或OctoMACS分選器（#130-042-109）；
❖ LS分選柱對(duì)應(yīng)的Midi MACS分選器（#130-042-302）或QuadroMACS分選器（#130-090-976）；
❖ MACS MultiStand（#130-042-303）
❖ MACS BSA Stock Solution（#130-091-376）和autoMACS Rinsing Solution（#130-091-222）1:20配置
❖ Pre-Separation Filters 30μm預(yù)分離濾器（#130-041-407）（可選，磁珠標(biāo)記前去除細(xì)胞團(tuán)，防止堵塞分選柱）

實(shí)驗(yàn)步驟
一、磁珠標(biāo)記CD45細(xì)胞
1.  細(xì)胞計(jì)數(shù)；
2.  細(xì)胞懸液300×g離心5分鐘，棄上清；
3.  細(xì)胞重懸，每1×10⁷細(xì)胞添加80μL分選緩沖液；
4.  每1×10⁷細(xì)胞添加20 μL CD45 (TIL) MicroBead磁珠；
5.  混勻，于2-8℃孵育15min；
6. （可選）添加熒光染色抗體 
7.添加分選緩沖液，調(diào)整溶液體積至500 μL（注：500 μL體積最大重懸至5×10⁷細(xì)胞，對(duì)于更多的細(xì)胞數(shù)量，需要相應(yīng)提高緩沖液體積）

二、磁珠分選CD45細(xì)胞
1. 將分選柱放入對(duì)應(yīng)的MACS分選器的磁場(chǎng)中，需詳細(xì)分選柱信息請(qǐng)查看MACS分選柱載量數(shù)據(jù)表；
2. 用適量緩沖液潤(rùn)洗分選柱，等到分選柱中液體排空后，再進(jìn)行下一步驟（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液潤(rùn)洗；LS分選柱使用3 mL分選緩沖液潤(rùn)洗）；
3. 將制備好的細(xì)胞懸液加入分選柱中，收集的流穿細(xì)胞液為未被標(biāo)記的細(xì)胞；
4. 分別用分選緩沖液清洗柱子（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液清洗3次；LS分選柱使用1 mL分選緩沖液清洗2次），收集未被標(biāo)記的非CD45細(xì)胞；
5. 從分選器中取出分選柱，將其放到合適的收集管上；
6. 吸取適量的緩沖液（MS：1 mL；LS：3 mL），加到分選柱中，立即將栓塞推入分選柱中，沖洗出磁珠標(biāo)記的細(xì)胞，即為CD45細(xì)胞；
7. （可選）若需提高 CD45⁺細(xì)胞純度，可將洗脫組分用新的 MS 或 LS 柱子重復(fù)步驟 1-6 再次分選。

陽(yáng)性分選：CD8 (TIL) MicroBeads, mouse（#130-116-478）

磁性分選耗材
❖ MS分選柱（#130-042-201）或LS分選柱（#130-042-401）
❖ MS分選柱對(duì)應(yīng)的Mini MACS分選器（#130-042-102）或OctoMACS分選器（#130-042-109）；
❖ LS分選柱對(duì)應(yīng)的Midi MACS分選器（#130-042-302）或QuadroMACS分選器（#130-090-976）；
❖ MACS MultiStand（#130-042-303）
❖ MACS BSA Stock Solution（#130-091-376）和autoMACS Rinsing Solution（#130-091-222）1:20配置
❖ Pre-Separation Filters 30μm預(yù)分離濾器（#130-041-407）（可選，磁珠標(biāo)記前去除細(xì)胞團(tuán)，防止堵塞分選柱）

實(shí)驗(yàn)步驟
一、磁珠標(biāo)記CD8細(xì)胞
1.  細(xì)胞計(jì)數(shù)；
2.  細(xì)胞懸液300×g離心10分鐘，棄上清；
3.  細(xì)胞重懸，每1×10⁷細(xì)胞添加90μL分選緩沖液；
4.  每1×10⁷細(xì)胞添加10 μL CD8 (TIL) MicroBead磁珠；
5.  混勻，于2-8℃孵育15min；
6. （可選）添加熒光染色抗體 
7.添加分選緩沖液，調(diào)整溶液體積至500 μL（注：500 μL體積最大重懸至5×10⁷細(xì)胞，對(duì)于更多的細(xì)胞數(shù)量，需要相應(yīng)提高緩沖液體積，并且磁性分選時(shí)需將樣本分至多個(gè)柱子中進(jìn)行操作）

二、磁珠分選CD8細(xì)胞
1. 將分選柱放入對(duì)應(yīng)的MACS分選器的磁場(chǎng)中，如需詳細(xì)分選柱信息請(qǐng)查看MACS分選柱載量數(shù)據(jù)表；
2. 用適量緩沖液潤(rùn)洗分選柱，等到分選柱中液體排空后，再進(jìn)行下一步驟（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液潤(rùn)洗；LS分選柱使用3 mL分選緩沖液潤(rùn)洗）；
3. 將制備好的細(xì)胞懸液加入分選柱中，收集的流穿細(xì)胞液為未被標(biāo)記的細(xì)胞；
4. 分別用分選緩沖液清洗柱子兩次（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液清洗2次；LS分選柱使用1 mL分選緩沖液清洗2次），收集未被標(biāo)記的非CD8細(xì)胞；
5. 從分選器中取出分選柱，將其放到合適的收集管上；
6. 吸取適量的緩沖液（MS：1 mL；LS：3 mL），加到分選柱中，立即將栓塞推入分選柱中，沖洗出磁珠標(biāo)記的細(xì)胞，即為CD8細(xì)胞；
7. （可選）若需提高 CD8⁺細(xì)胞純度，可將洗脫下來(lái)的細(xì)胞組分用新的 MS 或 LS 柱子重復(fù)步驟 1-6 再次分選。

以上就是三款熱門TIL細(xì)胞磁珠分選的實(shí)驗(yàn)流程！想了解更多TIL細(xì)胞磁珠產(chǎn)品，小優(yōu)為您總結(jié)了TIL細(xì)胞分選磁珠產(chǎn)品合集：

Human TIL細(xì)胞分選：
貨號(hào)130-118-780 CD45 (TIL) MicroBeads
貨號(hào)130-121-562 REAlease CD3 (TlL) MicroBead Kit, human
貨號(hào)130-121-563 REAlease® CD45 (TIL) MicroBead Kit, human
貨號(hào)130-121-559 REAlease CD4 (TlL) MicroBead Kit, human
貨號(hào)130-121-560 REAlease CD8 (TlL) MicroBead Kit, human
貨號(hào)130-121-561 REAlease CD4/CD8(TIL) MicroBead Kit, human

Mouse TIL細(xì)胞分選：
貨號(hào) 130-110-618 CD45 (TIL) MicroBeads, mousa
貨號(hào) 130-116-475 CD4(TIL)MicroBeads, mouse
貨號(hào) 130-116-478 CD8 (TIL) MicroBeads, mouse
貨號(hào) 130-116-480 CD4/CD8(1lL)MicroBeads, mouse

參考文獻(xiàn)：
[1] Kumar A, Watkins R, Vilgelm AE. Cell Therapy With TILs: Training and Taming T Cells to Fight Cancer. Front Immunol. 2021;12:690499. doi: 10.3389/fimmu.2021.690499

[2] Su W, Che L, Liao W, et al. The RNA m6A writer METTL3 in tumor microenvironment: emerging roles and therapeutic implications. Front Immunol. 2024;15:1335774. doi:10.3389/fimmu.2024.1335774