MST技術(shù)在分子層面揭示免疫增效子PcrIIC1的作用
01 研究背景
CRISPR系統(tǒng)是在原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可保護(hù)宿主細(xì)胞免受外來(lái)DNA的入侵。作為噬菌體和細(xì)菌免疫系統(tǒng)之間持續(xù)斗爭(zhēng)的一部分，CRISPR系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)化成各種類型，每種類型都具有不同的功能。Cas9蛋白通過(guò)向?qū)NA（sgRNA）切割外源DNA的免疫特性被廣泛研究和應(yīng)用到基因編輯領(lǐng)域。II型Cas9是這些系統(tǒng)中研究最廣泛的，具有多種亞型。目前尚不確定該家族成員是否能進(jìn)化出額外的機(jī)制來(lái)對(duì)抗病毒入侵。
本期文獻(xiàn)，研究者們通過(guò)前期鑒定大量基因及蛋白預(yù)測(cè)工作，揭示了II-C型Cas9的三個(gè)結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)軌跡，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了Chrysobacterium物種的CbCas9會(huì)與CRISPR–Cas系統(tǒng)促進(jìn)（pro-CRISPR）蛋白（PcrIIC1）形成異源四聚體復(fù)合物。驗(yàn)證PcrIIC1能夠作為一種CRISPR免疫增效子。作者借助MST技術(shù)直接在分子層面直觀揭示了PcrIIC1免疫增效子的增強(qiáng)效果，降低實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)難度，節(jié)省大量成本和時(shí)間。
02 研究?jī)?nèi)容
2024年5月29日，清華大學(xué)生命學(xué)院劉俊杰 (Jun-Jie Gogo Liu) 課題組聯(lián)合北京大學(xué)生命學(xué)院白洋課題組和清華大學(xué)生命學(xué)院陳春來(lái)課題組在 Nature 雜志在線發(fā)表了題為“Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity” 的研究論文。
研究者鑒定了2062個(gè)完整的Cas9基因座，預(yù)測(cè)出相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)，并揭示了II-C型Cas9的三個(gè)結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)軌跡。研究者發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)基因（NAG）往往存在于較大的II-C Cas9的基因座中。通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)和冷凍電鏡解析復(fù)合體結(jié)構(gòu)表明，來(lái)自金黃色細(xì)菌屬（Chryseobacterium sp.）的CbCas9生長(zhǎng)出了一個(gè)全新的增強(qiáng)Cas9活性的β-REC2結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)全新的能夠與其關(guān)聯(lián)基因PcrIIC1互作的CTH結(jié)構(gòu)域。通過(guò)蛋白間相互作用，2個(gè)CbCas9蛋白和2個(gè)PcrIIC1蛋白能夠形成異源四聚體復(fù)合物。這意味著PcrIIC1可以在整個(gè)CRISPR防御過(guò)程中與CbCas9結(jié)合。
為什么PcrIIC1要和Cas9結(jié)合呢？研究者通過(guò)MST實(shí)驗(yàn)直觀地揭曉了答案。
MST實(shí)驗(yàn)顯示PcrIIC1和apo-CbCas9之間具有中等的結(jié)合親和力（Kd=2.56±0.28μM）（圖1a）。值得注意的是，PcrIIC1和CbCas9–sgRNA之間的結(jié)合親和力增加到334±120 nM的Kd值，PcrIIC1和Cb Cas9–sgRNA–dsDNA之間的結(jié)合親和性增加到275±86 nM（28 bp）（圖1b，c），表明sgRNA表達(dá)可能作為天然宿主中異源四聚體組裝的檢查點(diǎn)。（CRISPR免疫防御系統(tǒng)是通過(guò)Cas9蛋白與sgRNA結(jié)合來(lái)切割外源DNA來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這個(gè)特性也被廣泛研究和應(yīng)用到基因編輯領(lǐng)域。）
圖1. MST和冷凍電鏡分析CbCas9和PcrIIC1結(jié)合的三個(gè)階段
CbCas9與PcrIIC1結(jié)合后復(fù)合物有什么作用，為什么說(shuō)PcrIIC1是免疫增效子呢？
MST實(shí)驗(yàn)也給出了直觀的答案。與單獨(dú)的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1復(fù)合物表現(xiàn)出增強(qiáng)的DNA結(jié)合（圖2a）進(jìn)而體現(xiàn)出切割活性，對(duì)原間隔區(qū)相鄰基序序列的兼容性更廣，對(duì)錯(cuò)配的耐受性更強(qiáng)，抗噬菌體免疫性增強(qiáng)。
圖2. PcrIIC1增強(qiáng)CbCas9的DNA結(jié)合(a)、切割(b)、PAM兼容性(c)、DNA解旋 (d) 和錯(cuò)配容忍 (e) 能力
*圖片來(lái)源https://life.tsinghua.edu.cn/info/1131/5848.htm
最后，為了檢驗(yàn)CRISPR免疫增效子PcrIIC1對(duì)CbCas9抗噬菌體免疫能力的影響，研究人員在大腸桿菌中進(jìn)行了抗噬菌體實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PcrIIC1顯著提升CbCas9系統(tǒng)對(duì)噬菌體的抵抗，且如果破壞CbCas9與PcrIIC1的相互作用，會(huì)導(dǎo)致增強(qiáng)的免疫力喪失。以上結(jié)果說(shuō)明CbCas9-PcrIIC1復(fù)合體的形成對(duì)整個(gè)CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫增強(qiáng)至關(guān)重要。
03 技術(shù)優(yōu)勢(shì)
本研究利用MST技術(shù)在分子層面直觀的揭示了免疫增效子PcrIIC1的作用。對(duì)于分子互作親和力的檢測(cè)，Monolith系列儀器不依賴于分子量變化，蛋白用量少，是一種在溶液狀態(tài)下表征分子互作的技術(shù)。對(duì)于蛋白可能需要形成多聚體，在溶液環(huán)境下，更能有效的體現(xiàn)蛋白與蛋白互作的真實(shí)情況。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)形成復(fù)合物后，進(jìn)一步的功能探究，如蛋白復(fù)合物與核酸的相互作用，通過(guò)Monolith系列儀器進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)便，能夠直觀地展示相互作用的結(jié)果，從而凸顯您研究的分子功能。
CRISPR系統(tǒng)是在原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可保護(hù)宿主細(xì)胞免受外來(lái)DNA的入侵。作為噬菌體和細(xì)菌免疫系統(tǒng)之間持續(xù)斗爭(zhēng)的一部分，CRISPR系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)化成各種類型，每種類型都具有不同的功能。Cas9蛋白通過(guò)向?qū)NA（sgRNA）切割外源DNA的免疫特性被廣泛研究和應(yīng)用到基因編輯領(lǐng)域。II型Cas9是這些系統(tǒng)中研究最廣泛的，具有多種亞型。目前尚不確定該家族成員是否能進(jìn)化出額外的機(jī)制來(lái)對(duì)抗病毒入侵。
本期文獻(xiàn)，研究者們通過(guò)前期鑒定大量基因及蛋白預(yù)測(cè)工作，揭示了II-C型Cas9的三個(gè)結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)軌跡，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了Chrysobacterium物種的CbCas9會(huì)與CRISPR–Cas系統(tǒng)促進(jìn)（pro-CRISPR）蛋白（PcrIIC1）形成異源四聚體復(fù)合物。驗(yàn)證PcrIIC1能夠作為一種CRISPR免疫增效子。作者借助MST技術(shù)直接在分子層面直觀揭示了PcrIIC1免疫增效子的增強(qiáng)效果，降低實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)難度，節(jié)省大量成本和時(shí)間。
02 研究?jī)?nèi)容
2024年5月29日，清華大學(xué)生命學(xué)院劉俊杰 (Jun-Jie Gogo Liu) 課題組聯(lián)合北京大學(xué)生命學(xué)院白洋課題組和清華大學(xué)生命學(xué)院陳春來(lái)課題組在 Nature 雜志在線發(fā)表了題為“Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity” 的研究論文。
研究者鑒定了2062個(gè)完整的Cas9基因座，預(yù)測(cè)出相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)，并揭示了II-C型Cas9的三個(gè)結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)軌跡。研究者發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)基因（NAG）往往存在于較大的II-C Cas9的基因座中。通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)和冷凍電鏡解析復(fù)合體結(jié)構(gòu)表明，來(lái)自金黃色細(xì)菌屬（Chryseobacterium sp.）的CbCas9生長(zhǎng)出了一個(gè)全新的增強(qiáng)Cas9活性的β-REC2結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)全新的能夠與其關(guān)聯(lián)基因PcrIIC1互作的CTH結(jié)構(gòu)域。通過(guò)蛋白間相互作用，2個(gè)CbCas9蛋白和2個(gè)PcrIIC1蛋白能夠形成異源四聚體復(fù)合物。這意味著PcrIIC1可以在整個(gè)CRISPR防御過(guò)程中與CbCas9結(jié)合。
為什么PcrIIC1要和Cas9結(jié)合呢？研究者通過(guò)MST實(shí)驗(yàn)直觀地揭曉了答案。
MST實(shí)驗(yàn)顯示PcrIIC1和apo-CbCas9之間具有中等的結(jié)合親和力（Kd=2.56±0.28μM）（圖1a）。值得注意的是，PcrIIC1和CbCas9–sgRNA之間的結(jié)合親和力增加到334±120 nM的Kd值，PcrIIC1和Cb Cas9–sgRNA–dsDNA之間的結(jié)合親和性增加到275±86 nM（28 bp）（圖1b，c），表明sgRNA表達(dá)可能作為天然宿主中異源四聚體組裝的檢查點(diǎn)。（CRISPR免疫防御系統(tǒng)是通過(guò)Cas9蛋白與sgRNA結(jié)合來(lái)切割外源DNA來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這個(gè)特性也被廣泛研究和應(yīng)用到基因編輯領(lǐng)域。）
圖1. MST和冷凍電鏡分析CbCas9和PcrIIC1結(jié)合的三個(gè)階段
CbCas9與PcrIIC1結(jié)合后復(fù)合物有什么作用，為什么說(shuō)PcrIIC1是免疫增效子呢？
MST實(shí)驗(yàn)也給出了直觀的答案。與單獨(dú)的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1復(fù)合物表現(xiàn)出增強(qiáng)的DNA結(jié)合（圖2a）進(jìn)而體現(xiàn)出切割活性，對(duì)原間隔區(qū)相鄰基序序列的兼容性更廣，對(duì)錯(cuò)配的耐受性更強(qiáng)，抗噬菌體免疫性增強(qiáng)。
圖2. PcrIIC1增強(qiáng)CbCas9的DNA結(jié)合(a)、切割(b)、PAM兼容性(c)、DNA解旋 (d) 和錯(cuò)配容忍 (e) 能力
*圖片來(lái)源https://life.tsinghua.edu.cn/info/1131/5848.htm
最后，為了檢驗(yàn)CRISPR免疫增效子PcrIIC1對(duì)CbCas9抗噬菌體免疫能力的影響，研究人員在大腸桿菌中進(jìn)行了抗噬菌體實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PcrIIC1顯著提升CbCas9系統(tǒng)對(duì)噬菌體的抵抗，且如果破壞CbCas9與PcrIIC1的相互作用，會(huì)導(dǎo)致增強(qiáng)的免疫力喪失。以上結(jié)果說(shuō)明CbCas9-PcrIIC1復(fù)合體的形成對(duì)整個(gè)CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫增強(qiáng)至關(guān)重要。
03 技術(shù)優(yōu)勢(shì)
本研究利用MST技術(shù)在分子層面直觀的揭示了免疫增效子PcrIIC1的作用。對(duì)于分子互作親和力的檢測(cè)，Monolith系列儀器不依賴于分子量變化，蛋白用量少，是一種在溶液狀態(tài)下表征分子互作的技術(shù)。對(duì)于蛋白可能需要形成多聚體，在溶液環(huán)境下，更能有效的體現(xiàn)蛋白與蛋白互作的真實(shí)情況。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)形成復(fù)合物后，進(jìn)一步的功能探究，如蛋白復(fù)合物與核酸的相互作用，通過(guò)Monolith系列儀器進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)便，能夠直觀地展示相互作用的結(jié)果，從而凸顯您研究的分子功能。
Monolith分子互作檢測(cè)儀
標(biāo)簽：
分子互作
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