案例分享：培養(yǎng)基及補(bǔ)料策略對CHO細(xì)胞生長及抗體質(zhì)量的影響

細(xì)胞代謝和蛋白質(zhì)量受多方面因素影響，包括表達(dá)系統(tǒng)、工藝條件、培養(yǎng)基及補(bǔ)料策略等。CHO 細(xì)胞因自身系統(tǒng)優(yōu)勢，在生物制藥行業(yè)已被廣泛用于各類蛋白藥物的生產(chǎn)表達(dá)，越來越受關(guān)注。

CHO 細(xì)胞是生產(chǎn)蛋白類藥物的首選宿主細(xì)胞，尤其在一些復(fù)雜的重組蛋白生產(chǎn)中，因其與其他系統(tǒng)相比有以下優(yōu)點：CHO 細(xì)胞對蛋白有準(zhǔn)確的加工、修飾功能，因此其表達(dá)的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性更接近于天然蛋白；CHO 細(xì)胞耐受剪切力和滲透壓的能力相對較強(qiáng)，可根據(jù)培養(yǎng)要求選擇可貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的方式；整合外源基因后的細(xì)胞穩(wěn)定，重組基因能高效擴(kuò)增和表達(dá)；CHO 細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白可由細(xì)胞內(nèi)運輸?shù)郊?xì)胞外，并且 CHO 細(xì)胞只表達(dá)少量的內(nèi)源蛋白，有利于目的蛋白的提取。

培養(yǎng)基及補(bǔ)料策略對 CHO 細(xì)胞生長及抗體質(zhì)量的影響案例分享

1.研究概況        
本研究案例使用化學(xué)成分限定的 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)基及補(bǔ)料策略對不同細(xì)胞系進(jìn)行 batch 和 fed-batch 培養(yǎng)，考察對細(xì)胞代謝、抗體濃度及質(zhì)量的影響。
采用生產(chǎn)相同抗體的 CHO-K1、CHO-DG44 和 CHO-S 細(xì)胞系在 ActiPro（GE HyClone）and Media A 培養(yǎng)基中，使用特定濃縮補(bǔ)料進(jìn)行 batch 和 fed-batch 培養(yǎng)，研究分析不同培養(yǎng)基及補(bǔ)料對于抗體產(chǎn)量、細(xì)胞生長、細(xì)胞特異性的營養(yǎng)消耗、副產(chǎn)物成分及 IgG 質(zhì)量的影響。 

2. 材料和方法  
 
3.分析方法
每天抽取樣品以確定細(xì)胞濃度，活力，IgG 滴度，代謝物（包括葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸、銨），滲透壓。 此外，在第 4 天（指數(shù)中期生長期），第 7 天（結(jié)束指數(shù)生長期）和培養(yǎng)終止日（活力<60％），通過流式細(xì)胞儀分析殘留氨基酸濃度，基因拷貝數(shù)和 mRNA，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物含量，通過 SDS-PAGE，Western 印跡，糖基化，聚合體，電荷異構(gòu)體和熱穩(wěn)定性等分析抗體質(zhì)量。
每個試驗組均做三份平行， 通過加入葡萄糖濃縮液將殘留葡萄糖濃度維持在 3 g / L 以上。

4.結(jié)果
相比 batch 培養(yǎng)模式，fed-batch 策略可顯著延長培養(yǎng)持續(xù)時間，提高細(xì)胞峰濃度，抗體終濃度可提高至六倍以上（數(shù)據(jù)未顯示）。
如下圖所示，當(dāng) ActiPro 用作三種重組細(xì)胞系（CHO-K1，CHO-DG44 和 CHO-S）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基時，可獲得最高的細(xì)胞密度和抗體濃度。ActiPro 中較高的比生長速率帶來較高的細(xì)胞峰密度和活細(xì)胞積分（高達(dá)五倍差異）。兩種培養(yǎng)基中細(xì)胞生長比較發(fā)現(xiàn) IgG 滴度高達(dá)六倍的差異（圖 1B）。IgG 產(chǎn)生的特定速率與三種 CHO 細(xì)胞系細(xì)胞內(nèi)輕鏈和重鏈 mRNA 表達(dá)水平非常一致（數(shù)據(jù)未顯示），ActiPro 在 fed-batch 模式中較高的活細(xì)胞積分是獲得更高抗體濃度的主要原因。
 
本案例中兩種 fed-batch 策略明顯影響細(xì)胞代謝速率，包括營養(yǎng)物質(zhì)消耗和副產(chǎn)物形成（數(shù)據(jù)未顯示）。培養(yǎng)于 Medium A 中時，三種細(xì)胞系的葡萄糖消耗率均高達(dá) 30-55%，而且具有細(xì)胞特異性。同時三種細(xì)胞系葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸的比例也具有明顯差異，其中 CHO S 細(xì)胞最低，約為 10-15%，CHO-DG44 細(xì)胞 為 25%, CHO-K1 細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸的比例最高，可達(dá) 40%。
谷氨酰胺是 CHO 細(xì)胞的主要能量來源，谷氨酰胺消耗為高度宿主細(xì)胞特異性，同種細(xì)胞系在兩種培養(yǎng)基中消耗比例大致相同。三種細(xì)胞系在 Media A fed-batch 培養(yǎng)中谷氨酰胺均為凈消耗，而在 ActiPro 培養(yǎng)物中則觀察到凈生成，這一發(fā)現(xiàn)可能會影響未來補(bǔ)料策略的設(shè)計。兩種培養(yǎng)基中，CHO-K1 細(xì)胞系銨生成率保持不變，而在 CHO-S 和 CHO-DG44 細(xì)胞系中，ActiPro 相比 Media A 銨生成率低 30-60％。
所有三份 fed-batch 培養(yǎng)物的培養(yǎng)上清液進(jìn)行純化，通過不同技術(shù)分析抗體質(zhì)量。所有樣品在 SDS-PAGE 上看起來均一，純度高且具有正確的分子量，通過 SEC 測定聚合體小于 5％（數(shù)據(jù)未顯示）。抗體 Fc 結(jié)構(gòu)域的糖基化變化與 CHO 細(xì)胞系的使用以及補(bǔ)料策略有關(guān)（數(shù)據(jù)未顯示），通常高巖藻糖化出現(xiàn)在 CHO-S 細(xì)胞系及 Media A 培養(yǎng)基 fed-batch 培養(yǎng)中，CHO-S 和 CHO-K1 細(xì)胞系培養(yǎng)于 ActiPro 生產(chǎn)的抗體有更高水平的半乳糖化，甘露糖結(jié)構(gòu)在 CHO-S 中被最有效地加工（最低的高甘露糖結(jié)構(gòu)），然后是 CHO-K1 和 CHO-DG44。

5.總結(jié)
本案例中細(xì)胞培養(yǎng)基和補(bǔ)料策略對抗體生產(chǎn)過程及產(chǎn)量影響大，不同培養(yǎng)基間細(xì)胞峰值密度有 5 倍差別，抗體滴度高達(dá) 6 倍差別。細(xì)胞代謝速率（例如葡萄糖和谷氨酸）也受培養(yǎng)基的影響，乳酸生產(chǎn)及谷氨酰胺消耗（均有細(xì)胞特異性）主要取決于 CHO 細(xì)胞系。對于產(chǎn)品質(zhì)量，培養(yǎng)基和 CHO 宿主細(xì)胞系的選擇均可用于微調(diào)抗體糖基化，例如巖藻糖基化，半乳糖基化和甘露糖基化等。

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Cytiva（思拓凡）——HyClone™ ActiPro™ 細(xì)胞培養(yǎng)基
HyClone™ ActiPro™ 細(xì)胞培養(yǎng)基采用特殊配方，有助于使用中國倉鼠卵巢 (CHO) 細(xì)胞系的生物工藝提高重組蛋白產(chǎn)量。此培養(yǎng)基化學(xué)成分明確且無動物源性成分 (ADCF)，并經(jīng)過優(yōu)化，適用于分批或 CHO 分批補(bǔ)料細(xì)胞培養(yǎng)工藝的高產(chǎn)量蛋白表達(dá)和生產(chǎn)。
• 經(jīng)證明，可提高重組蛋白的產(chǎn)量
• 不含次黃嘌呤和胸苷（HAT 添加劑）
• 化學(xué)成分明確的 ADCF mAb 培養(yǎng)基制劑
• 用于分批或分批補(bǔ)料發(fā)酵工藝的生產(chǎn)培養(yǎng)基  
HyClone™ ActiPro™ 細(xì)胞培養(yǎng)基提供液體和粉末兩種形式，用于細(xì)胞培養(yǎng)生物工藝。此培養(yǎng)基化學(xué)成分明確，用于與 HyClone ActiSM™ 培養(yǎng)基以及 Cell Boost™ 7a 和 Cell Boost™ 7b 添加劑搭配使用。ActiPro™ 培養(yǎng)基和添加劑經(jīng)過專門配制，適用于重組蛋白生產(chǎn)，包括需要復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后修飾和正確折疊的蛋白。此外，此精心設(shè)計的 ActiPro™ 培養(yǎng)基和添加劑系統(tǒng)可以顯著減少生產(chǎn)時間。
ActiPro™ 系統(tǒng)適用于使用 CHO 細(xì)胞系（例如 CHO-GS、CHO-K1、CHO-DG44 和 CHO-S）進(jìn)行的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)工藝。ActiPro™ 細(xì)胞培養(yǎng)基和添加劑的設(shè)計注重適應(yīng)性和 CHO 蛋白生產(chǎn)效率。ActiPro™ 培養(yǎng)基和添加劑是氨基酸、維生素、鹽、微量元素等成分均衡的制劑，可滿足生產(chǎn)中 CHO 細(xì)胞的代謝需求。該細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)不含多肽、水解物、酚紅、2-巰基乙醇或生長因子（例如胰島素），可確保批次間一致性并提高細(xì)胞培養(yǎng)的生物工藝效率。對于碳消耗量較高的快速生長的 CHO 細(xì)胞，需要葡萄糖添加劑。
 
綜合前文對 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)特性、培養(yǎng)基與補(bǔ)料策略影響的分析，以及思拓凡的HyClone™ ActiPro™細(xì)胞培養(yǎng)基在實際研究中展現(xiàn)的突出性能 —— 不僅能顯著提升 CHO-K1、CHO-DG44、CHO-S 等細(xì)胞系的峰值密度與活細(xì)胞積分，助力抗體滴度實現(xiàn)最高 6 倍提升，還可通過精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞代謝、優(yōu)化抗體糖基化等關(guān)鍵質(zhì)量屬性，充分滿足高收率 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)與重組蛋白生產(chǎn)的核心需求。其化學(xué)成分明確、無動物源性成分且適配分批 / 分批補(bǔ)料等多種工藝的特性，更能保障生產(chǎn)穩(wěn)定性與效率。因此，無論是從科學(xué)研究數(shù)據(jù)支撐，還是從工業(yè)化生產(chǎn)適配性來看，思拓凡的HyClone™ ActiPro™細(xì)胞培養(yǎng)基都是推動 CHO 細(xì)胞重組蛋白高效生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)選擇，為生物制藥領(lǐng)域相關(guān)工藝的優(yōu)化與升級提供可靠助力。