Revolution顯微鏡助力組蛋白修飾如何通過脂質(zhì)代謝抵抗淀粉樣蛋白毒性

導(dǎo)讀
本研究聚焦核心科學(xué)問題：早期生命組蛋白修飾變化如何通過非經(jīng)典通路（非熱休克依賴）調(diào)控脂質(zhì)代謝以抵抗淀粉樣毒性。區(qū)別于傳統(tǒng)衰老研究的核心創(chuàng)新點(diǎn)在于，突破“組蛋白修飾→轉(zhuǎn)錄調(diào)控→應(yīng)激反應(yīng)”的經(jīng)典范式，首次揭示 H3K4me3 表觀遺傳標(biāo)記通過 HSF-1 非熱休克依賴通路調(diào)控脂質(zhì)代謝重編程，進(jìn)而建立早期發(fā)育事件與晚年淀粉樣蛋白毒性之間的因果聯(lián)系。

作者采用“模型構(gòu)建-干預(yù)策略-檢測(cè)指標(biāo)”三層遞進(jìn)式實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)框架，通過特異性模型選擇、多維度干預(yù)驗(yàn)證及互補(bǔ)性檢測(cè)技術(shù)的整合應(yīng)用，系統(tǒng)探究神經(jīng)退行性疾病的分子機(jī)制。以下從三個(gè)維度展開方法學(xué)解析：

其中，合理的模型構(gòu)建是研究的第一步也是極其重要的一步。作者針對(duì)不同病理表型選擇了兩種轉(zhuǎn)基因線蟲模型：CL4176株系與GRU102株系。CL4176線蟲通過溫度誘導(dǎo)特異性表達(dá)人源Aβ1-42蛋白，可模擬阿爾茨海默病的Aβ誘導(dǎo)癱瘓表型，其癱瘓率隨誘導(dǎo)時(shí)間呈劑量依賴性增加，適用于評(píng)估候選藥物的抗Aβ毒性作用；GRU102株系則表達(dá)突變型亨廷頓蛋白（polyQ35），主要表現(xiàn)為神經(jīng)元毒性致死效應(yīng)，神經(jīng)元存活率與polyQ聚集程度呈負(fù)相關(guān)，為研究蛋白聚集相關(guān)神經(jīng)毒性提供理想模型。兩種模型的選擇分別對(duì)應(yīng)了神經(jīng)退行性疾病中“功能喪失”與“結(jié)構(gòu)破壞”的核心病理特征，實(shí)現(xiàn)了研究問題與模型生物學(xué)特性的精準(zhǔn)匹配。

美國(guó)密歇根大學(xué)的Bryndon J Oleson等研究人員在《Nature Aging》 雜志上發(fā)表了題為《Early life changes in histone landscape protect against age-associated amyloid toxicities through HSF-1-dependent regulation of lipid metabolism》的文章。文中的油紅染色結(jié)果和免疫熒光結(jié)果均應(yīng)用Revolution 顯微鏡進(jìn)行顯微成像。

    應(yīng)用亮點(diǎn)      

一、蛋白聚集可視化與定量分析

通過Revolution顯微鏡觀察Q40::YFP聚集體的形成，能夠快速獲取tiff熒光單色圖，直接計(jì)數(shù)不同處理組（對(duì)照組、ash-2/set-2敲除組）線蟲的聚集體數(shù)量（補(bǔ)充圖1 E-H）。

COMPASS復(fù)合物缺失雖增加聚集體數(shù)量（如set-2敲除株Q40::YFP熒光焦點(diǎn)數(shù)增加1.8倍），但顯著延緩癱瘓表型，證實(shí)聚集物質(zhì)量而非數(shù)量與毒性相關(guān)，為“組蛋白修飾-脂質(zhì)代謝-毒性抵抗”機(jī)制提供核心表型證據(jù)。

二、基因表達(dá)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

利用GFP報(bào)告基因系統(tǒng)（如fat-7p::fat-7::GFP等），由于存在表達(dá)量較低的樣本，Revolution能夠高靈敏的準(zhǔn)確獲取這些弱熒光信號(hào)，通過熒光強(qiáng)度定量分析基因表達(dá)變化。

1、證實(shí)了在COMPASS復(fù)合體成員被耗盡時(shí)fat-7表達(dá)顯著增加，而且還表明fat-7的表達(dá)水平受到HSF-1的嚴(yán)格控制。通過RNAi敲低hsf-1顯著降低了L4440對(duì)照、ash-2和set-2 RNAi株系中的fat-7表達(dá)水平，基本上消除了ash-2或set-2耗盡引起的任何fat-7水平的增加。（圖2 b-d）

2、油酸不會(huì)激活或增強(qiáng)熱休克反應(yīng)：表達(dá)hsp-16.2p：：GFP報(bào)告蛋白的L4或1天成體的線蟲，在對(duì)照RNAi (L4440) 條件下培養(yǎng)，由于需要比對(duì)，熒光的準(zhǔn)確性極其重要，Revolution快速獲取準(zhǔn)確的熒光圖像，避免假陰性結(jié)果產(chǎn)生。其熒光結(jié)果顯示，油酸不影響其熱休克。

三、脂質(zhì)分布與形態(tài)觀察

采用Oil Red O染色結(jié)合光學(xué)顯微鏡，觀察線蟲整體脂質(zhì)積累。Revolution通過大圖拼接，能夠快速獲取整個(gè)線蟲的完整圖像，對(duì)于分析整體脂質(zhì)積累至關(guān)重要。

1、在油酸上生長(zhǎng)時(shí)，HSF-1耗盡的線蟲比野生型或ash-2耗盡的線蟲的ORO信號(hào)更高（圖3c，d）；hsf-1 缺乏的 Q40：：YFP 線蟲不再表現(xiàn)出與 hsf-1 水平降低相關(guān)的發(fā)育缺陷（圖 3e，f）。結(jié)果顯示HSF-1直接或間接控制油酸生成下游的一個(gè)或多個(gè)額外步驟，這些步驟對(duì)于保護(hù)秀麗隱桿線蟲免受晚年淀粉樣蛋白毒性至關(guān)重要。

2、H3K4me3修飾劑或hsf-1耗竭及油酸補(bǔ)充對(duì)脂質(zhì)本體富集和脂滴形成的影響（補(bǔ)充圖4 C-H）。

通過Revolution顯微鏡的快速優(yōu)質(zhì)成像，作者的實(shí)驗(yàn)效率獲得了極大的提高，得到了所需的高清圖片，采集到了準(zhǔn)確的熒光信號(hào)，不僅獲取了圖像數(shù)據(jù)，還可使用原圖進(jìn)行定量分析，最終得到整個(gè)結(jié)論。該項(xiàng)研究揭示了早期組蛋白景觀變化、熱休克無關(guān)HSF-1活性及脂質(zhì)代謝改變與晚年對(duì)年齡相關(guān)淀粉樣蛋白毒性的保護(hù)之間存在此前未知的聯(lián)系。

原文鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11481004/#F8

期刊介紹
《Nature Aging》是Nature Portfolio于2021年推出的衰老研究領(lǐng)域頂級(jí)期刊，專注發(fā)表衰老生物學(xué)、年齡相關(guān)疾病機(jī)制及社會(huì)老齡化政策的高質(zhì)量研究，涵蓋從分子機(jī)制到臨床轉(zhuǎn)化的全鏈條探索。2024年影響因子為19.4，位列JCR老年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域Q1區(qū)第1位，中科院醫(yī)學(xué)大類1區(qū)Top期刊，是連接基礎(chǔ)研究與老年醫(yī)學(xué)應(yīng)用的核心學(xué)術(shù)平臺(tái)。