Science：利用大規(guī)模并行核糖體分析發(fā)現(xiàn)泛病毒ORF
2025年6月12日，美國麻省理工和博德研究所Pardis C.Sabeti團(tuán)隊(duì)在Science上發(fā)表了一篇題為“Pan-viral ORFs discovery using massively parallel ribosome profiling”的論文，結(jié)合寡核苷酸合成文庫和Ribo-seq核糖體印跡分析，開展泛病毒ORF挖掘，本研究旨在建立一種高效、無偏的泛病毒ORFs發(fā)現(xiàn)方法，填補(bǔ)病毒翻譯組學(xué)空白。
一、引言
盡管病毒基因組測序技術(shù)已有很大進(jìn)展， 但病毒基因組的功能注釋長期滯后于測序進(jìn)展。除了已注釋的經(jīng)典開放閱讀框（ORFs）之外，尤其是不符合傳統(tǒng)ORF的定義的非經(jīng)典ORFs（如非ATG起始、長度<100aa）在感染、免疫調(diào)控中的作用尚未系統(tǒng)探索。
傳統(tǒng)的病毒基因組注釋方法主要依賴于生物信息學(xué)預(yù)測，存在假陽性率高、無法區(qū)分功能性和非功能性O(shè)RFs等局限性。更重要的是，許多高致病性病毒（如埃博拉病毒、尼帕病毒等）難以在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)，需要在生物安全三級（BSL-3）或四級（BSL-4）設(shè)施中操作，極大限制了對這些病毒基因組的深入研究。
核糖體印跡分析也稱為Ribo-seq，此項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展極大提升了檢測基因組翻譯區(qū)域的能力。該技術(shù)利用對核糖體結(jié)合的RNA片段進(jìn)行深度測序，確定核糖體占位情況，從而以單核苷酸分辨率揭示翻譯區(qū)域。它已經(jīng)在哺乳動物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌和病毒中發(fā)現(xiàn)了許多非經(jīng)典ORFs，包括5′非翻譯區(qū)（5′UTRs）中的上游ORFs（uORFs）和上游重疊ORFs（uoORFs）、非編碼RNA中的短ORFs以及已注釋編碼序列中的重疊內(nèi)部ORFs（iORFs）。
然而，傳統(tǒng)核糖體圖譜技術(shù)在病毒研究中面臨三大瓶頸：病毒培養(yǎng)困難、安全要求高、遺傳多樣性強(qiáng)。每種病毒需要特定的培養(yǎng)系統(tǒng)，部分病毒無法在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；高致病性病毒需要高等級生物安全設(shè)施；單一病毒株分析無法覆蓋變異譜系，導(dǎo)致全球多數(shù)病毒的翻譯圖譜仍是"黑箱"。
為解決這些挑戰(zhàn)，博德研究所的Shira Weingarten-Gabbay和Pardis C. Sabeti團(tuán)隊(duì)開發(fā)了大規(guī)模平行核糖體圖譜（MPRP）技術(shù)。該技術(shù)創(chuàng)新性地將高通量寡核苷酸合成與核糖體圖譜技術(shù)相結(jié)合，在一次實(shí)驗(yàn)中可同時(shí)分析數(shù)百種病毒的翻譯事件，無需病毒培養(yǎng)或高生物安全等級設(shè)施，極大降低了實(shí)驗(yàn)門檻。這一技術(shù)突破為病毒基因組研究提供了全新的方法學(xué)工具，有望徹底改變我們對病毒蛋白質(zhì)組的認(rèn)知。
二、技術(shù)設(shè)計(jì)與方法
MPRP技術(shù)的核心原理是利用合成寡核苷酸文庫替代活病毒，通過Ribo檢測病毒基因組片段的翻譯活性。
1.文庫構(gòu)建：研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了包含20,170個(gè)合成寡核苷酸的文庫，覆蓋679種人類相關(guān)病毒基因組的3,976個(gè)基因的5'非翻譯區(qū)（5'UTR）和編碼區(qū)起始區(qū)域。每個(gè)寡核苷酸包含60個(gè)核苷酸的5'UTR和140個(gè)核苷酸的編碼區(qū)，確保能夠捕獲翻譯起始位點(diǎn)和上游調(diào)控序列。
2.并行檢測：將文庫轉(zhuǎn)染至HEK293T/A549細(xì)胞，在病毒感染相關(guān)應(yīng)激條件（如poly(I:C)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激）下進(jìn)行核糖體分析，使用抑制劑區(qū)分起始/延伸核糖體。
3.數(shù)據(jù)處理：采用PRICE（Probabilistic Ribo-seq Inference of Coding Exons）算法從核糖體足跡數(shù)據(jù)中推斷ORFs，并通過免疫肽組學(xué)驗(yàn)證HLA-I呈遞。
4.跨平臺驗(yàn)證：對比MPRP數(shù)據(jù)與HCMV、VSV等天然感染細(xì)胞的Ribo-seq結(jié)果，確�？煽啃浴�
三、研究結(jié)果
3.1 病毒ORFs的大規(guī)模發(fā)現(xiàn)
MPRP技術(shù)在679種病毒中實(shí)現(xiàn)了數(shù)量級的發(fā)現(xiàn)突破，共鑒定出5,381個(gè)病毒ORFs，其中4,208個(gè)為非經(jīng)典ORFs，覆蓋皰疹病毒、冠狀病毒、絲狀病毒等21個(gè)病毒家族。這些新發(fā)現(xiàn)的ORFs極大擴(kuò)展了我們對病毒蛋白質(zhì)組的認(rèn)知邊界，揭示了病毒基因組中存在大量此前未被注釋的翻譯區(qū)域。
ORF類型的多樣性令人矚目。研究發(fā)現(xiàn)了多種類型的非經(jīng)典ORFs：上游ORFs（uORFs）位于5'UTR區(qū)域，如HCMV UL45 5'UTR的uORF可導(dǎo)致核糖體停滯，抑制主CDS翻譯；內(nèi)部重疊ORFs（iORFs）如IAV M1基因+1框架的iORF，在H5N1等6種流感毒株中保守存在；非ATG起始ORFs如HCMV中以GUG、UUG起始的ORFs，編碼20個(gè)氨基酸以下的微蛋白。這些不同類型的ORFs可能在病毒生命周期中發(fā)揮多樣化的功能。
盡管病毒基因組測序技術(shù)已有很大進(jìn)展， 但病毒基因組的功能注釋長期滯后于測序進(jìn)展。除了已注釋的經(jīng)典開放閱讀框（ORFs）之外，尤其是不符合傳統(tǒng)ORF的定義的非經(jīng)典ORFs（如非ATG起始、長度<100aa）在感染、免疫調(diào)控中的作用尚未系統(tǒng)探索。
傳統(tǒng)的病毒基因組注釋方法主要依賴于生物信息學(xué)預(yù)測，存在假陽性率高、無法區(qū)分功能性和非功能性O(shè)RFs等局限性。更重要的是，許多高致病性病毒（如埃博拉病毒、尼帕病毒等）難以在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)，需要在生物安全三級（BSL-3）或四級（BSL-4）設(shè)施中操作，極大限制了對這些病毒基因組的深入研究。
核糖體印跡分析也稱為Ribo-seq，此項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展極大提升了檢測基因組翻譯區(qū)域的能力。該技術(shù)利用對核糖體結(jié)合的RNA片段進(jìn)行深度測序，確定核糖體占位情況，從而以單核苷酸分辨率揭示翻譯區(qū)域。它已經(jīng)在哺乳動物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌和病毒中發(fā)現(xiàn)了許多非經(jīng)典ORFs，包括5′非翻譯區(qū)（5′UTRs）中的上游ORFs（uORFs）和上游重疊ORFs（uoORFs）、非編碼RNA中的短ORFs以及已注釋編碼序列中的重疊內(nèi)部ORFs（iORFs）。
然而，傳統(tǒng)核糖體圖譜技術(shù)在病毒研究中面臨三大瓶頸：病毒培養(yǎng)困難、安全要求高、遺傳多樣性強(qiáng)。每種病毒需要特定的培養(yǎng)系統(tǒng)，部分病毒無法在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；高致病性病毒需要高等級生物安全設(shè)施；單一病毒株分析無法覆蓋變異譜系，導(dǎo)致全球多數(shù)病毒的翻譯圖譜仍是"黑箱"。
為解決這些挑戰(zhàn)，博德研究所的Shira Weingarten-Gabbay和Pardis C. Sabeti團(tuán)隊(duì)開發(fā)了大規(guī)模平行核糖體圖譜（MPRP）技術(shù)。該技術(shù)創(chuàng)新性地將高通量寡核苷酸合成與核糖體圖譜技術(shù)相結(jié)合，在一次實(shí)驗(yàn)中可同時(shí)分析數(shù)百種病毒的翻譯事件，無需病毒培養(yǎng)或高生物安全等級設(shè)施，極大降低了實(shí)驗(yàn)門檻。這一技術(shù)突破為病毒基因組研究提供了全新的方法學(xué)工具，有望徹底改變我們對病毒蛋白質(zhì)組的認(rèn)知。
二、技術(shù)設(shè)計(jì)與方法
MPRP技術(shù)的核心原理是利用合成寡核苷酸文庫替代活病毒，通過Ribo檢測病毒基因組片段的翻譯活性。
1.文庫構(gòu)建：研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了包含20,170個(gè)合成寡核苷酸的文庫，覆蓋679種人類相關(guān)病毒基因組的3,976個(gè)基因的5'非翻譯區(qū)（5'UTR）和編碼區(qū)起始區(qū)域。每個(gè)寡核苷酸包含60個(gè)核苷酸的5'UTR和140個(gè)核苷酸的編碼區(qū)，確保能夠捕獲翻譯起始位點(diǎn)和上游調(diào)控序列。
2.并行檢測：將文庫轉(zhuǎn)染至HEK293T/A549細(xì)胞，在病毒感染相關(guān)應(yīng)激條件（如poly(I:C)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激）下進(jìn)行核糖體分析，使用抑制劑區(qū)分起始/延伸核糖體。
3.數(shù)據(jù)處理：采用PRICE（Probabilistic Ribo-seq Inference of Coding Exons）算法從核糖體足跡數(shù)據(jù)中推斷ORFs，并通過免疫肽組學(xué)驗(yàn)證HLA-I呈遞。
4.跨平臺驗(yàn)證：對比MPRP數(shù)據(jù)與HCMV、VSV等天然感染細(xì)胞的Ribo-seq結(jié)果，確�？煽啃浴�
三、研究結(jié)果
3.1 病毒ORFs的大規(guī)模發(fā)現(xiàn)
MPRP技術(shù)在679種病毒中實(shí)現(xiàn)了數(shù)量級的發(fā)現(xiàn)突破，共鑒定出5,381個(gè)病毒ORFs，其中4,208個(gè)為非經(jīng)典ORFs，覆蓋皰疹病毒、冠狀病毒、絲狀病毒等21個(gè)病毒家族。這些新發(fā)現(xiàn)的ORFs極大擴(kuò)展了我們對病毒蛋白質(zhì)組的認(rèn)知邊界，揭示了病毒基因組中存在大量此前未被注釋的翻譯區(qū)域。
ORF類型的多樣性令人矚目。研究發(fā)現(xiàn)了多種類型的非經(jīng)典ORFs：上游ORFs（uORFs）位于5'UTR區(qū)域，如HCMV UL45 5'UTR的uORF可導(dǎo)致核糖體停滯，抑制主CDS翻譯；內(nèi)部重疊ORFs（iORFs）如IAV M1基因+1框架的iORF，在H5N1等6種流感毒株中保守存在；非ATG起始ORFs如HCMV中以GUG、UUG起始的ORFs，編碼20個(gè)氨基酸以下的微蛋白。這些不同類型的ORFs可能在病毒生命周期中發(fā)揮多樣化的功能。
技術(shù)性能評估顯示，在3,976個(gè)注釋的病毒CDS中，PRICE算法成功捕獲了1,136個(gè)（28%）在注釋起始密碼子處起始的ORFs，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率為0.05。雖然捕獲率看似不高，但考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的復(fù)雜性和病毒基因組的多樣性，這一結(jié)果仍具有重要意義。更重要的是，PRICE檢測到的CDS在兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)中的核糖體占用率顯示出高相關(guān)性（R=0.93），證明了檢測結(jié)果的可靠性。
3.2 非經(jīng)典ORFs的免疫原性驗(yàn)證
研究的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是非經(jīng)典ORFs具有顯著的免疫原性。通過分析感染細(xì)胞的免疫肽組數(shù)據(jù)集，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)MPRP鑒定的非經(jīng)典ORFs能夠產(chǎn)生人類白細(xì)胞抗原I類（HLA-I）相關(guān)肽段。在HCMV中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)非經(jīng)典ORF來源的5種肽段，如UL4 5'UTR uORF的VLSAKKLS、UL135 5'UTR uoORF的YPAPRPQAI；在VACV中發(fā)現(xiàn)了2種肽段，如L3L iORF的HRNKIINAEK，這些肽段均被HLAthena預(yù)測為高親和力HLA-I結(jié)合者（MSi rank ≤2）。
免疫貢獻(xiàn)的量化分析揭示了非經(jīng)典ORFs的重要性。將MPRP鑒定的ORF納入HCMV注釋后，HLA-I呈遞肽段數(shù)量增加7.4%，且非經(jīng)典ORF的單位長度產(chǎn)肽量顯著高于經(jīng)典ORF（P<10⁻³）。這一發(fā)現(xiàn)表明，非經(jīng)典ORFs不僅能夠編碼功能性肽段，還具有更高的免疫原性密度，可能在病毒免疫逃逸和宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。
研究的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是非經(jīng)典ORFs具有顯著的免疫原性。通過分析感染細(xì)胞的免疫肽組數(shù)據(jù)集，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)MPRP鑒定的非經(jīng)典ORFs能夠產(chǎn)生人類白細(xì)胞抗原I類（HLA-I）相關(guān)肽段。在HCMV中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)非經(jīng)典ORF來源的5種肽段，如UL4 5'UTR uORF的VLSAKKLS、UL135 5'UTR uoORF的YPAPRPQAI；在VACV中發(fā)現(xiàn)了2種肽段，如L3L iORF的HRNKIINAEK，這些肽段均被HLAthena預(yù)測為高親和力HLA-I結(jié)合者（MSi rank ≤2）。
免疫貢獻(xiàn)的量化分析揭示了非經(jīng)典ORFs的重要性。將MPRP鑒定的ORF納入HCMV注釋后，HLA-I呈遞肽段數(shù)量增加7.4%，且非經(jīng)典ORF的單位長度產(chǎn)肽量顯著高于經(jīng)典ORF（P<10⁻³）。這一發(fā)現(xiàn)表明，非經(jīng)典ORFs不僅能夠編碼功能性肽段，還具有更高的免疫原性密度，可能在病毒免疫逃逸和宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。
3.3 uORF對病毒翻譯的調(diào)控機(jī)制
研究揭示了上游ORFs（uORFs）對病毒蛋白翻譯的精細(xì)調(diào)控機(jī)制。在正常條件下，2,418個(gè)病毒基因中37%的核糖體聚集在5'UTR（uORF區(qū)域），抑制主CDS翻譯；亞砷酸鈉誘導(dǎo)eIF2α磷酸化后，核糖體向CDS轉(zhuǎn)移，5'UTR聚集比例降至19%，證實(shí)uORF通過eIF2α通路調(diào)控翻譯起始。
功能保守性證據(jù)表明uORF的調(diào)控作用在不同實(shí)驗(yàn)條件下具有一致性。HCMV UL4 5'UTR的uORF在MPRP和天然感染細(xì)胞中均導(dǎo)致核糖體停滯，其編碼的核糖體停滯肽（RAP）可抑制主蛋白翻譯。三核苷酸周期性分析顯示，在5'UTR區(qū)域檢測到的uORFs具有活躍的核糖體翻譯特征，且在LTM抑制劑存在下，這些uORFs的起始密碼子處顯示強(qiáng)烈的起始核糖體信號。
研究還發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)激條件下（如eIF2α磷酸化），核糖體更容易繞過5'UTR中的uORFs，在主CDS處起始翻譯，這與抑制性uORF的預(yù)期行為一致。這一發(fā)現(xiàn)為理解病毒如何在不同細(xì)胞環(huán)境中調(diào)控蛋白合成提供了重要見解，也為開發(fā)針對病毒翻譯調(diào)控的治療策略提供了潛在靶點(diǎn)。
研究揭示了上游ORFs（uORFs）對病毒蛋白翻譯的精細(xì)調(diào)控機(jī)制。在正常條件下，2,418個(gè)病毒基因中37%的核糖體聚集在5'UTR（uORF區(qū)域），抑制主CDS翻譯；亞砷酸鈉誘導(dǎo)eIF2α磷酸化后，核糖體向CDS轉(zhuǎn)移，5'UTR聚集比例降至19%，證實(shí)uORF通過eIF2α通路調(diào)控翻譯起始。
功能保守性證據(jù)表明uORF的調(diào)控作用在不同實(shí)驗(yàn)條件下具有一致性。HCMV UL4 5'UTR的uORF在MPRP和天然感染細(xì)胞中均導(dǎo)致核糖體停滯，其編碼的核糖體停滯肽（RAP）可抑制主蛋白翻譯。三核苷酸周期性分析顯示，在5'UTR區(qū)域檢測到的uORFs具有活躍的核糖體翻譯特征，且在LTM抑制劑存在下，這些uORFs的起始密碼子處顯示強(qiáng)烈的起始核糖體信號。
研究還發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)激條件下（如eIF2α磷酸化），核糖體更容易繞過5'UTR中的uORFs，在主CDS處起始翻譯，這與抑制性uORF的預(yù)期行為一致。這一發(fā)現(xiàn)為理解病毒如何在不同細(xì)胞環(huán)境中調(diào)控蛋白合成提供了重要見解，也為開發(fā)針對病毒翻譯調(diào)控的治療策略提供了潛在靶點(diǎn)。
四、結(jié)論
MPRP技術(shù)為病毒基因組研究帶來了范式轉(zhuǎn)變，通過揭示病毒基因組中大量"隱藏"的ORFs， 不僅擴(kuò)展了病毒蛋白質(zhì)組的邊界，更為疫苗開發(fā)、抗病毒藥物研發(fā)和疫情防控提供了重要機(jī)遇。 這一技術(shù)突破不僅是科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，更是人類抗擊病毒的重要武器。
MPRP技術(shù)為病毒基因組研究帶來了范式轉(zhuǎn)變，通過揭示病毒基因組中大量"隱藏"的ORFs， 不僅擴(kuò)展了病毒蛋白質(zhì)組的邊界，更為疫苗開發(fā)、抗病毒藥物研發(fā)和疫情防控提供了重要機(jī)遇。 這一技術(shù)突破不僅是科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，更是人類抗擊病毒的重要武器。
標(biāo)簽：
Science
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