USP10去泛素化與自噬偶聯(lián)致心臟鈉通道降解并引發(fā)心律失常的機(jī)制研究

簡介:

SCN5A基因編碼Nav1.5通道，Nav1.5通道負(fù)責(zé)心肌細(xì)胞動作電位（AP）的除極和傳導(dǎo)，該通道維持心臟正常的電生理功能。Nav1.5的功能缺失變異會降低鈉電流密度（I_Na），并導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)阻滯或Brugada綜合征等心律失常。目前對Nav1.5功能的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。

基于此，武漢大學(xué)中南醫(yī)院心內(nèi)科魯志兵教授團(tuán)隊(duì)與華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王擎教授團(tuán)隊(duì)合作，在Cardiovascular Research發(fā)表題為“Coupling of USP10 de-ubiquitination and chaperone-mediated autophagy causes cardiac sodium channel degradation and cardiac arrhythmias”的研究論文。

本研究旨在鑒定與Nav1.5相互作用的新型蛋白質(zhì)（去泛素化酶USP10），并闡明其對Nav1.5及心律失常的調(diào)控機(jī)制。

結(jié)論：
作者發(fā)現(xiàn)了一種新型伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA)介導(dǎo)的通路，通過與USP10介導(dǎo)的Nav1.5 K430位點(diǎn)去泛素化作用相結(jié)合，調(diào)控Nav1.5的降解，從而導(dǎo)致內(nèi)向鈉電流密度降低和心臟傳導(dǎo)異常。敲低USP10可緩解Scn5a+/−小鼠的心律失常，為治療內(nèi)向鈉電流減少相關(guān)的心律失常提供了新治療策略。

研究結(jié)果：

1. 將USP10鑒定為一種新型Nav1.5-interacting 蛋白，降低心臟鈉電流密度及Nav1.5蛋白表達(dá)
為鑒定Nav1.5的新調(diào)控機(jī)制，研究人員以其胞質(zhì)區(qū)域?yàn)楂C物蛋白，通過GST下拉實(shí)驗(yàn)篩選小鼠心臟蛋白裂解液中的互作蛋白，在−130 kDa位置鑒定出去泛素化酶USP10，質(zhì)譜分析及內(nèi)源性Co-IP實(shí)驗(yàn)均證實(shí)二者互作。進(jìn)一步通過構(gòu)建USP10不同結(jié)構(gòu)域表達(dá)質(zhì)粒，結(jié)合Co-IP和GST下拉實(shí)驗(yàn)，明確Nav1.5與USP10的USP結(jié)構(gòu)域而非N端相互作用，純化蛋白實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該互作的直接性。免疫熒光染色顯示，USP10與Nav1.5在心肌細(xì)胞中共定位。綜上，USP10通過其USP結(jié)構(gòu)域與Nav1.5直接互作。

研究運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)探究USP10對Nav1.5的調(diào)控：在NRCMs、HEK293/Nav1.5細(xì)胞系及hESC-CMs中，過表達(dá)USP10均顯著降低INa密度，NRCMs中失活曲線偏移而激活曲線無變化，HEK293/Nav1.5中該調(diào)控可被USP10 C424A突變消除，敲低USP10則INa密度升高。表達(dá)檢測顯示，USP10過表達(dá)降低Nav1.5蛋白總量及質(zhì)膜表達(dá)，不影響Scn5a mRNA水平，敲低則提升其蛋白表達(dá)，證實(shí)USP10下調(diào)Nav1.5蛋白表達(dá)與INa密度。此外，研究發(fā)現(xiàn)心衰患者心臟中USP10蛋白表達(dá)較健康組顯著增加。

圖1. USP10被鑒定為Nav1.5的新型負(fù)調(diào)控蛋白

2. USP10過表達(dá)導(dǎo)致自發(fā)性心臟傳導(dǎo)異常，并誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)室性心動過速
研究通過AAV9病毒遞送系統(tǒng)在小鼠心臟過表達(dá)USP10，經(jīng)qPCR、Western blot及免疫熒光驗(yàn)證，確認(rèn)USP10成功過表達(dá)且感染效率超85%。遙測心電圖顯示，過表達(dá)小鼠P波持續(xù)時間、PR及QRS間期顯著延長，出現(xiàn)自發(fā)性竇性停搏和房室傳導(dǎo)阻滯，對照組無此現(xiàn)象；光學(xué)標(biāo)測證實(shí)其竇性及起搏模式下激活時間延長、傳導(dǎo)速度降低。程序性電刺激實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)小鼠室性心動過速（VT）誘發(fā)率高，對照組未誘發(fā)。此外，氟卡尼未誘發(fā)VT，兩組6個月均無自發(fā)性死亡，心功能無顯著差異，綜上USP10過表達(dá)導(dǎo)致小鼠心臟傳導(dǎo)阻滯并誘發(fā)VT。

圖2. USP10過表達(dá)導(dǎo)致小鼠心臟傳導(dǎo)阻滯

3. USP10過表達(dá)改變了小鼠INa和ICa-L的密度和APD持續(xù)時間
研究分離USP10過表達(dá)的小鼠成年心室心肌細(xì)胞，檢測其離子通道電流與動作電位：全細(xì)胞電壓鉗顯示，小鼠心肌細(xì)胞INa密度顯著降低且失活閾正向偏移，晚INa無變化，ICa-L密度降低但激活/失活特性不變，Ito、IK1、Iss無組間差異；在表達(dá)人源鉀通道的HEK293細(xì)胞中，USP10也不影響人類Ito、IKr特性。動作電位檢測發(fā)現(xiàn)，靜息膜電位無差異，但APA、Vmax、APD90和APD50均降低，提示INa降低與傳導(dǎo)異常相關(guān)，ICa-L減少或致APD降低。此外，USP10過表達(dá)顯著降低小鼠心臟Nav1.5蛋白表達(dá)，而相關(guān)心律失常離子通道基因mRNA表達(dá)無差異。

圖3. USP10過表達(dá)改變小鼠離子通道特性

4. 敲低USP10可恢復(fù)Scn5a+/−小鼠的鈉電流減少及心律失常
研究利用CRISPR-Cas9構(gòu)建Scn5a+/−小鼠并注射AAV9-shRNA-USP10或?qū)φ蛰d體，發(fā)現(xiàn)Scn5a+/−小鼠Nav1.5蛋白表達(dá)、INa 及 ICa-L 密度均顯著降低，Ito、IK1、Iss 電流無差異。注射AAV9-shRNA-USP10后，小鼠Nav1.5蛋白表達(dá)、INa 密度回升，ICa-L 密度恢復(fù)至野生型水平，AP參數(shù)也恢復(fù)正常。遙測心電圖顯示其傳導(dǎo)異常改善，室性早搏消失，證實(shí)體內(nèi)敲低USP10可通過恢復(fù)INa和ICa-L密度，減輕Scn5a+/−小鼠的心臟傳導(dǎo)異常。

圖4. USP10基因敲除恢復(fù)了Scn5a雜合敲除小鼠中降低的I_Na和I_Cal-L

圖5. 使用shRNA敲低USP10可減輕Scn5a^+/−小鼠的心律失常

5. USP10通過CMA促進(jìn)Nav1.5降解，Nav1.5基序EKRFQ431—435位于環(huán)I中，參與CMA介導(dǎo)的Nav1.5降解
研究探究USP10降低Nav1.5蛋白表達(dá)的機(jī)制：USP10不影響Scn5a的轉(zhuǎn)錄與翻譯，而是通過降低Nav1.5蛋白穩(wěn)定性促進(jìn)其降解。蛋白酶體抑制劑MG132無作用，巨自噬抑制劑亦不影響，僅自噬抑制劑氯喹可阻斷該效應(yīng)，且抑制CMA關(guān)鍵分子LAMP2A或HSC70能阻礙USP10功能，證實(shí)依賴CMA途徑。Co-IP顯示Nav1.5與HSC70相互作用，其環(huán)I的EKRFQ431-435基序?yàn)殛P(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)，該基序突變可阻斷互作、恢復(fù)Nav1.5表達(dá)及INa密度，表明Nav1.5是CMA底物，此基序介導(dǎo)其CMA降解。

圖6. USP10通過分子伴侶介導(dǎo)的自噬促進(jìn)Nav1.5降解

6. USP10介導(dǎo)的Nav1.5 K430位點(diǎn)去泛素化促進(jìn)Nav1.5的CMA降解
研究探究USP10促進(jìn)Nav1.5的CMA降解機(jī)制：因Nav1.5的 EKRFQ431-435基序緊鄰USP10結(jié)合位點(diǎn)K430，推測其影響 Nav1.5與HSC70的結(jié)合，實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)USP10可顯著增強(qiáng)二者結(jié)合。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)USP10 能降低Nav1.5泛素化水平，經(jīng)突變實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，K430是其去泛素化的關(guān)鍵位點(diǎn)，K430R突變可阻斷該作用，還能抑制USP10對Nav1.5表達(dá)及INa密度的下調(diào)效應(yīng)，揭示了去泛素化與 CMA偶聯(lián)降解Nav1.5的新機(jī)制。

圖7. USP10對Nav1.5 K430位點(diǎn)的去泛素化作用增強(qiáng)了CMA介導(dǎo)的Nav1.5降解