SMLM技術(shù)突破：40微米深度超分辨率成像成功應(yīng)用于3D細(xì)胞培養(yǎng)模型

單分子定位顯微鏡（SMLM）技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，以其納米級(jí)分辨能力在生物學(xué)研究中展現(xiàn)出巨大潛力，但深度成像始終是技術(shù)瓶頸。研究團(tuán)隊(duì)提出了一種名為soSMARt的創(chuàng)新解決方案，通過(guò)結(jié)合自適應(yīng)光學(xué)、單目標(biāo)光片顯微鏡和微加工設(shè)備，實(shí)現(xiàn)了深度體積SMLM成像。soSMARt技術(shù)利用集成45°微鏡和熒光基準(zhǔn)標(biāo)記的智能設(shè)備，在實(shí)時(shí)校正光學(xué)像差和機(jī)械漂移的同時(shí)，支持全細(xì)胞尺度乃至復(fù)雜組織的納米級(jí)三維重建。該技術(shù)不僅提升了成像分辨率和穩(wěn)定性，還通過(guò)自動(dòng)化流程大幅縮短了采集時(shí)間，為生物醫(yī)學(xué)研究提供了新工具。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，soSMARt在核膜、線粒體網(wǎng)絡(luò)和膜受體成像中取得了橫向分辨率達(dá)7.0納米、軸向分辨率40.5納米的優(yōu)異性能，并成功應(yīng)用于3D細(xì)胞培養(yǎng)模型，標(biāo)志著SMLM技術(shù)向深度、定量化邁出關(guān)鍵一步。

本論文的重要發(fā)現(xiàn)者包括Marine Cabillic、Hisham Forriere、Laetitia Bettarel、Corey Butler、Abdelghani Neuhaus、Ihssane Idrissi、Miguel Edouardo Sambrano-Lopez、Julian Rossbroich、Lucas-Raphael Miller、Jonas Ries、Gianluca Grenci、Virgile Viasnoff、Florian Levet、Jean-Baptiste Sibarita和Rémi Galland。他們的合作研究成果以《In-depth single molecule localization microscopy using adaptive optics and single objective light-sheet microscopy》為題，于2025年9月在《Nature Communications》期刊上在線發(fā)表。

重要發(fā)現(xiàn)
soSMARt技術(shù)的核心在于解決了深度SMLM成像中的三大挑戰(zhàn)：光學(xué)像差、機(jī)械漂移和體積重建難題。通過(guò)自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)，研究人員首先量化了深度依賴(lài)的像差效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)成像深度超過(guò)10微米時(shí)，球形像差會(huì)線性增加，導(dǎo)致點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)變形，進(jìn)而影響定位精度。為此，團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了基于Zernike模式的3N校正算法，利用微設(shè)備中嵌入的熒光納米鉆石作為基準(zhǔn)點(diǎn)，在成像深度實(shí)時(shí)校正像差。這一過(guò)程結(jié)合了60納米均方根值的像散誘導(dǎo)，優(yōu)化了三維定位的斜率曲線，確保軸向定位精度在40納米以內(nèi)。值得注意的是，校正后像差對(duì)定位的影響降低了21%，顯著提升了重建質(zhì)量。

實(shí)時(shí)漂移校正是soSMARt的另一大突破。由于單目標(biāo)光片顯微鏡的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，任何橫向漂移都會(huì)導(dǎo)致激發(fā)光片與檢測(cè)平面錯(cuò)位。團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了SMARtrack軟件，通過(guò)跟蹤微設(shè)備中均勻分布的納米鉆石標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)納米級(jí)的三維反饋循環(huán)漂移校正。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，校正后的殘留漂移精度達(dá)到橫向6.4納米、軸向12.9納米，優(yōu)于傳統(tǒng)完美對(duì)焦系統(tǒng)。這種主動(dòng)校正機(jī)制允許長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)的穩(wěn)定采集，為體積成像奠定了基礎(chǔ)。在核膜成像實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)DNA-PAINT技術(shù)采集30,000幀圖像，耗時(shí)50分鐘，最終重建出297,736個(gè)定位點(diǎn)，傅里葉環(huán)相關(guān)分析顯示徑向分辨率達(dá)31納米。

深度學(xué)習(xí)加速成像進(jìn)一步拓展了soSMARt的應(yīng)用邊界。通過(guò)集成DECODE算法，團(tuán)隊(duì)將成像時(shí)間縮短了一個(gè)數(shù)量級(jí)。在核膜實(shí)驗(yàn)中，僅用1.5小時(shí)就完成了20個(gè)平面的采集，生成186萬(wàn)定位點(diǎn)，分辨率達(dá)42納米。盡管出現(xiàn)了網(wǎng)格偽影，但傅里葉濾波有效抑制了干擾。這種高密度定位策略為大規(guī)模篩查提供了可能，尤其適合動(dòng)態(tài)生物過(guò)程研究。

在復(fù)雜樣品成像中，soSMARt技術(shù)展現(xiàn)了適應(yīng)性。以HepG2癌細(xì)胞球體為例，利用JeWells設(shè)備進(jìn)行三維培養(yǎng)，并通過(guò)光片照明實(shí)現(xiàn)了30微米深度的SMLM成像。重建后的核膜厚度測(cè)量為138納米，雖然當(dāng)前設(shè)備尚不支持全深度基準(zhǔn)標(biāo)記集成，但通過(guò)跨相關(guān)校正仍獲得了54納米的分辨率。多視角照明潛力為未來(lái)擴(kuò)大視場(chǎng)指明了方向。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
soSMARt技術(shù)的創(chuàng)新性首先體現(xiàn)在其多模態(tài)集成策略上。傳統(tǒng)SMLM依賴(lài)TIRF或HILO照明，局限于近蓋玻片區(qū)域，而soSMARt通過(guò)單目標(biāo)光片顯微鏡（soSPIM）架構(gòu)，將激發(fā)光片經(jīng)45°微鏡反射至樣品深度，實(shí)現(xiàn)了光學(xué)切片與高數(shù)值孔徑收集的兼顧。這種設(shè)計(jì)突破了多目標(biāo)光片系統(tǒng)的機(jī)械限制，使成像深度擴(kuò)展至40微米以上。更重要的是，微加工設(shè)備中嵌入的熒光基準(zhǔn)標(biāo)記不僅為像差校正提供了參考，還通過(guò)SMARtrack軟件實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)三維漂移校正，將長(zhǎng)期采集的穩(wěn)定性提升至納米尺度。這種“智能顯微鏡”理念將硬件與算法無(wú)縫結(jié)合，為自動(dòng)化成像樹(shù)立了新標(biāo)準(zhǔn)。

在光學(xué)工程層面，soSMARt的創(chuàng)新在于深度依賴(lài)像差的動(dòng)態(tài)校正。團(tuán)隊(duì)首次系統(tǒng)量化了水浸物鏡下的像差變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)球形像差隨深度線性增加（斜率0.031弧度/微米），并通過(guò)自適應(yīng)光學(xué)系統(tǒng)實(shí)時(shí)補(bǔ)償。相較于傳統(tǒng)方法僅在蓋玻片表面校正，soSMARt在樣品深度直接優(yōu)化點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，使像散定位的斜率恢復(fù)至理想狀態(tài)。這一技術(shù)不僅提升了定位精度，還避免了重建偽影，如球形像差導(dǎo)致的“回聲”效應(yīng)。此外，通過(guò)可變形鏡面實(shí)現(xiàn)像散誘導(dǎo)與校正的一體化，簡(jiǎn)化了系統(tǒng)復(fù)雜度，提高了實(shí)用性。

soSMARt的亮點(diǎn)還體現(xiàn)在其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的廣度上。在單細(xì)胞層面，技術(shù)成功應(yīng)用于核膜、線粒體網(wǎng)絡(luò)和膜受體的納米級(jí)定量分析。例如，對(duì)Jurkat T細(xì)胞PD-1受體的簇分析揭示了其在細(xì)胞表面的均勻分布，為免疫治療研究提供了新見(jiàn)解。在三維細(xì)胞培養(yǎng)模型中，soSMARt與JeWells設(shè)備結(jié)合，首次實(shí)現(xiàn)了球體內(nèi)部的超分辨率成像，盡管樣品散射和像差挑戰(zhàn)更大，但光片照明的高光子收集效率保證了信噪比。這種兼容性預(yù)示著技術(shù)在組織工程和個(gè)性化醫(yī)療中的潛力。

總結(jié)與展望
soSMARt技術(shù)通過(guò)融合自適應(yīng)光學(xué)、單目標(biāo)光片顯微鏡和智能微設(shè)備，成功突破了深度SMLM成像的瓶頸，實(shí)現(xiàn)了納米級(jí)分辨率的體積重建與定量分析。其在像差校正、漂移控制和自動(dòng)化采集方面的創(chuàng)新，為細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究提供了強(qiáng)大工具。未來(lái)，技術(shù)有望進(jìn)一步優(yōu)化樣品誘導(dǎo)像差校正策略，并擴(kuò)展至活體動(dòng)態(tài)成像，推動(dòng)超分辨率顯微鏡在精準(zhǔn)醫(yī)療和藥物篩選中發(fā)揮更大作用。隨著算法與硬件的持續(xù)迭代，soSMARt或?qū)⒊蔀檫B接納米世界與宏觀生物系統(tǒng)的橋梁，開(kāi)啟三維超分辨率成像的新紀(jì)元。