使用結(jié)晶紫生物膜定量檢測法測試新型噬菌體的抗菌特性

大腸桿菌是人類和動物腸道中常見的細(xì)菌，通常有助于維持健康的微生物群落。然而，一些大腸桿菌菌株具有致病性，可引發(fā)嚴(yán)重疾病，如泌尿道感染、腹瀉、腦膜炎和敗血癥。致病性大腸桿菌對現(xiàn)有常用抗生素的耐藥性日益增強(qiáng)。因此，迫切需要研發(fā)具有抗菌特性的全新藥物，或?qū)ふ姨娲�方式來對抗這些感染。

噬菌體療法（phage therapy）是傳統(tǒng)抗生素的理想替代方案。噬菌體作為具有抗菌特性的病毒，能特異性感染細(xì)菌（導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞溶解），且對人類或動物無任何不良影響。

在本研究中，研究人員從醫(yī)院廢水中分離并鑒定出一種新型噬菌體（APTC-EC-2A）。該噬菌體對多株抗生素耐藥的大腸桿菌表現(xiàn)出良好的抗菌活性。

然而，大腸桿菌（以及許多其他細(xì)菌）能夠形成生物膜，而生物膜通常比浮游細(xì)菌更具耐藥性。為評估APTC-EC-2A對細(xì)菌生物膜的抗菌特性，研究中采用了結(jié)晶紫生物膜質(zhì)量定量法以及活/死菌活性檢測法。

1、結(jié)晶紫生物膜檢測法

結(jié)晶紫生物膜檢測法最早在30多年前發(fā)展應(yīng)用起來，并在此后不斷經(jīng)過改進(jìn)。其核心步驟為：在96孔板底部培養(yǎng)細(xì)菌生物膜，并分別加入不同濃度的噬菌體（或其他抗菌劑）進(jìn)行處理。隨后，殘留的黏附生物膜用結(jié)晶紫染色，未結(jié)合的染料洗去，再向孔內(nèi)加入30%醋酸溶解結(jié)合的染料。通過測定上清液在595nm的吸光值，可以推算出生物膜的質(zhì)量（圖 1）。

2、噬菌體效應(yīng)測試

簡要流程如下：

將1McFarland單位的E. coli XL10生理鹽水懸液以1:15稀釋到LB培養(yǎng)基中。

在96孔板中，一列6個孔僅加入LB培養(yǎng)基作為陰性對照，其余孔加入150µL細(xì)菌懸液。

37°C培養(yǎng)48小時以促進(jìn)生物膜形成，隨后用無菌1×PBS清洗兩次。

每孔加入200µL噬菌體溶液（濃度為5×10⁸pfu/mL或5×10⁹pfu/mL），LB培養(yǎng)基單獨(dú)作為陰性對照，LB+細(xì)菌懸液作為陽性對照。

37 °C再培養(yǎng)24小時。

噬菌體處理后，孔內(nèi)用無菌PBS清洗，去除浮游菌。

每孔加入0.1%結(jié)晶紫200µL染色15分鐘，用蒸餾水沖洗并過夜風(fēng)干。

每孔加入30%醋酸溶解染料，并測定595nm的吸光度。相對生物膜量通過與陽性對照吸光度比較獲得。

同樣的方法用于測試耐藥性的大腸桿菌菌株 ED、PC 和 378大腸桿菌菌株。

3、新型噬菌體降低生物膜生物量

結(jié)果顯示，所測試的噬菌體具有顯著的抗生物膜特性，且隨劑量增加，生物膜生物量呈劑量依賴性下降。

當(dāng) APTC-EC-2A 終濃度為1×10⁹ pfu時，明顯降低了XL10 Gold、ED、PC和378菌株的生物膜質(zhì)量，相比未處理對照具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（圖 2）。

• 當(dāng)終濃度為1×10⁸pfu時，生物膜質(zhì)量最高下降53%（范圍 16–54%）。

• 當(dāng)終濃度為1×10⁹pfu時，生物膜質(zhì)量最高下降70%（范圍 27–70%）。

采用LIVE/DEAD BacLight細(xì)菌存活性試劑盒來確定APTC-EC-2A噬菌體處理后E. coli細(xì)胞中存活（SYTO9，綠色）與死亡（PI，紅色）細(xì)胞的百分比。在APTC-EC-2A處理的生物膜中，E. coli XL10、ED和PC的死亡細(xì)胞百分比在兩種噬菌體濃度下均較未處理對照有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加。然而，對于E. coli 378，僅在最高濃度的APTC-EC-2A處理下才觀察到與對照相比顯著增加的細(xì)胞死亡率和抗菌特性（圖 3）。

結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)了一種對耐藥性大腸桿菌具有抗菌活性的新型噬菌體。其廣譜溶解活性及在寬pH值和溫度范圍內(nèi)的穩(wěn)定性，使其成為推進(jìn)臨床前及臨床開發(fā)的有前景候選物。

BMG LABTECH系列酶標(biāo)儀多年來廣泛應(yīng)用于細(xì)菌生長檢測。該設(shè)備可實(shí)現(xiàn)生長動力學(xué)曲線測定，并能根據(jù)需求提供培養(yǎng)功能及長期高強(qiáng)度振蕩。所有儀器均配備固態(tài)CCD分光計(jì)，可進(jìn)行220-1000nm波段的吸光度測量，使其成為測定抗菌藥物及其他藥物的理想平臺。

References

1. Hon,K., et al. APTC-EC-2A: A Lytic Phage Targeting Multidrug Resistant E. coli- Planktonic Cells and Biofilms. Microorganisms, 2022, 10, 102.

2. Staneva, A.D., et al. Antibiofouling Activity of Graphene Materials and Graphene-Based Antimicrobial Coatings. Microorganisms 2021, 9, 1839.

3. Stepanovic, S., et al. A modified microtiter-13 plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J Microbiol Methods, 40 14 (2000) 175.

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