IPS誘導(dǎo)之干細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化及腦類器官形成方法和步驟

 IPS誘導(dǎo)腦類器官培養(yǎng)分為兩大階段：多能干誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化，神經(jīng)干誘導(dǎo)形成腦類器官。

一、人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基配制
（1）2-8℃解凍hPSC Medium Supplement，融化后上下晃動(dòng)混勻，按實(shí)際用量進(jìn)行分裝，立即使用或儲(chǔ)存于-20~-80℃，避免反復(fù)凍融；
（2）按1:50的比例將 hPSC Medium Supplement(10mL)加入到hPSC Medium Basal Medium(500mL)中，混合均勻即成為人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基(abs9403)；

注意：混勻后的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基可在2-8℃穩(wěn)定儲(chǔ)存2-3周，不建議使用配制已超過(guò)3周的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基。

（3） 實(shí)驗(yàn)試劑平衡：人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)前放置室溫避光平衡；PBS，消化液等 37℃加熱。

注意：培養(yǎng)基中含有因子，不要37℃水浴加熱。

二、操作方法(以下步驟皆應(yīng)在無(wú)菌條件下操作)

hPSC細(xì)胞復(fù)蘇：
1、實(shí)驗(yàn)操作步驟：
1.1、基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1mL/0.5mL即用型基質(zhì)膠(abs9410)，輕輕晃動(dòng)6孔板/12孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h-2h，實(shí)驗(yàn)前拿出并置于超凈工作臺(tái)/生物安全柜中室溫下平衡20min。如果暫時(shí)不用，可用Parafilm封口后2-8℃儲(chǔ)存，并于1周內(nèi)使用。

注意：
① 一支凍存的干細(xì)胞的數(shù)量在1×10⁶cells/mL 左右，對(duì)應(yīng)6孔板1孔；
② 即用型基質(zhì)膠對(duì)溫度敏感，即用即拿，用完后立即放回4℃冰箱保存，且勿用手直接觸碰基質(zhì)膠液面所及的瓶身，影響基質(zhì)膠質(zhì)量。

1.2、先將2-3mL的干細(xì)胞培養(yǎng)基加入15mL離心管中備用。

1.3、解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中，快速搖動(dòng)，使其在1-2min內(nèi)快速解凍；

注意：細(xì)胞從液氮中拿出的速度要快，盡量減少其暴露在室溫中的時(shí)間。

1.4、離心：凍存管中的凍存液解凍后，將其逐滴加入含有干細(xì)胞培養(yǎng)基的15mL離心管中，將15mL離心管置于低速離心機(jī)中配比平衡后，1000rpm離心3min；

1.5、重懸：離心后棄上清加1mL人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3~5次左右。

1.6、接種：吹吸均勻后，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，將吹打均勻的干細(xì)胞懸液加入到已經(jīng)包被好的6孔板中，并補(bǔ)全每孔2mL培養(yǎng)體系。

1.7、培養(yǎng)：接種后的6孔板可以置于倒置相差顯微鏡下觀察接種的干細(xì)胞密度以及細(xì)胞團(tuán)塊大小，呈4個(gè)細(xì)胞以上的團(tuán)塊較合格，水平十字輕輕晃動(dòng)6孔板/12孔板使細(xì)胞均勻分布。并置于37℃，5%CO₂的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第2天觀察細(xì)胞貼壁情況；

1.8、換液：從復(fù)蘇的時(shí)間開(kāi)始每24h換液一次。

注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每 24h 應(yīng)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。

多能干細(xì)胞(PSCs)集落

hPSC 細(xì)胞傳代：

2、實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：
2.1、清洗：吸掉原有培養(yǎng)基，貼壁緩慢加入1mL PBS緩沖液并輕輕晃動(dòng)，然后沿培養(yǎng)皿邊緣吸去PBS緩沖液；

2.2、消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干細(xì)胞消化液(abs9409)使之覆蓋皿底，并置于37℃培養(yǎng)箱中2-5min；

注意：消化時(shí)間依據(jù)干細(xì)胞生長(zhǎng)密度，消化時(shí)間略有不同，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)一般建議時(shí)間2-5min。消化過(guò)程中可以拿到倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內(nèi)部細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，即可吸掉消化液終止消化。

2.3、吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，用移液槍扇形吹打培養(yǎng)皿底，輕柔吹打3-5次，使皿底干細(xì)胞集落脫落，并將其并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；

注意：吹吸皿底細(xì)胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數(shù)在3-5次為宜，盡量避免形成單細(xì)胞。如有少量細(xì)胞無(wú)法從皿底脫落，屬于正�，F(xiàn)象。如有大量細(xì)胞無(wú)法從皿底脫落，需延長(zhǎng)消化時(shí)間。

2.4、離心：1000rpm離心3min，棄上清；

2.5、接種：用干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打細(xì)胞5-10次，吸掉包被培養(yǎng)板中的基質(zhì)膠，并將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)板中，且補(bǔ)全每孔2mL的培養(yǎng)體系。
注意：吹打細(xì)胞要溫柔，并且吹打次數(shù)不要超過(guò)10次。

2.6、換液：從傳代的時(shí)間開(kāi)始每24h換液一次。
注意：因培養(yǎng)基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應(yīng)及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。

 

多能干細(xì)胞(PSCs)集落染色圖

hPSC 細(xì)胞凍存：

3、實(shí)驗(yàn)具體操作步驟：
3.1、清洗：同 2.1；
3.2、消化：同 2.2；
3.3、吹打：同 2.3；
3.4、離心：同 2.4；
3.5、重懸：離心后棄上清，加入2mL ES/iPS細(xì)胞凍存液(abs9412)對(duì)干細(xì)胞沉淀進(jìn)行吹吸混勻，吹吸3-5次后，將其加入到凍存管中；
注意：凍存液即用即拿，及時(shí)放回 4℃冰箱。

3.6、記錄：在凍存管上標(biāo)記凍存細(xì)胞種類、時(shí)間、操作者及細(xì)胞批次。

3.7、-80℃冰箱凍存：凍存管置于-80℃冰箱過(guò)夜。
注意：凍存管放置于-80℃冰箱時(shí)，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。

3.8、液氮凍存：24h后將-80℃冰箱中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮中長(zhǎng)期凍存。

二、人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化方法

誘導(dǎo)培養(yǎng)基準(zhǔn)備 
1、將冷凍的PSC補(bǔ)充液在2°C-8°C下解凍過(guò)夜，或在37°C水浴中快速解凍約5min。
2、解凍后的補(bǔ)充液可分裝成多個(gè)相同的等份，并在-5°C至-20°C保存，以制備較小體積的完整培養(yǎng)基。不要重新冷凍解凍。
3、將小瓶輕輕倒置幾次，混合解凍后的補(bǔ)充液。
4、從瓶中取出20mL PSC補(bǔ)充液，轉(zhuǎn)移到PSC培養(yǎng)基瓶中。旋轉(zhuǎn)瓶子混合，即得500mL人多功能干細(xì)胞(PSC) 誘導(dǎo)神經(jīng)干培養(yǎng)基(abs9822)，簡(jiǎn)稱誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
5、誘導(dǎo)培養(yǎng)基可在2°C-8°C保存2周。使用前，在37°C水浴中預(yù)熱當(dāng)天所需量的完整培養(yǎng)基5-10min。

PSC細(xì)胞準(zhǔn)備 
1、按照人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法—hPSC細(xì)胞復(fù)蘇步驟—1.1-1.8復(fù)蘇PSCs。
2、當(dāng)PSCs達(dá)到70-80%的融合度時(shí)，去除任何分化和部分分化的克隆。
3、對(duì)PSCs進(jìn)行傳代操作，按照人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法—hPSC細(xì)胞傳代步驟—2.1-2.4傳代
4、從新包被的6孔板中吸除包被液，并在每孔中加入2.5mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
5、輕輕搖動(dòng)含有誘導(dǎo)細(xì)胞懸液的離心管，將PSC以每孔2.5×10⁵ - 3×10⁵的細(xì)胞加入包被的6孔板中。例如，如果PSC懸液中的細(xì)胞團(tuán)濃度為1×10⁶個(gè)/mL，則在每孔中加入0.25-0.3mL的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
6、快速前后左右移動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散在培養(yǎng)皿表面，并將其輕輕置于37°C、5%CO₂的培養(yǎng)箱中。

注意：傳代PSCs 時(shí)，細(xì)胞應(yīng)以小團(tuán)塊的形式接種，而不是單個(gè)細(xì)胞懸液。避免將PSCs作為單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行接種，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加。

注意：您可以在分裂時(shí)將10μM ROCK抑制劑Y27632加入PSC培養(yǎng)基中過(guò)夜，以防止細(xì)胞死亡。

神經(jīng)誘導(dǎo) 
1、預(yù)熱誘導(dǎo)培養(yǎng)基至室溫。
2、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第0天（PSC傳代后約24h），PSC應(yīng)達(dá)到15-25%的融合度。抽吸廢培養(yǎng)基，在6孔板的每孔中加入2.5mL預(yù)熱好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿放入37°C、5%CO₂的培養(yǎng)箱中。
3、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第2天，細(xì)胞集落的形態(tài)應(yīng)該是一致的。標(biāo)記所有非神經(jīng)分化克隆，如果有的話，用巴斯德玻璃移液管或移液管尖端去除這些不需要的克隆。抽吸廢培養(yǎng)基，在6孔板的每孔中加入2.5 mL預(yù)熱好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱。
4、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第4天，細(xì)胞將達(dá)到融合。任何非神經(jīng)分化的克隆都應(yīng)標(biāo)記并移除。從每孔中抽吸廢培養(yǎng)基，每孔用5mL預(yù)熱的誘導(dǎo)培養(yǎng)基代替，將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱。
5、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第6天，細(xì)胞應(yīng)接近最大融合。去除任何非神經(jīng)分化克隆，在每個(gè)孔中加入5mL預(yù)熱的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱。
注：在神經(jīng)誘導(dǎo)的第4-7天，如果細(xì)胞的顏色變?yōu)楹稚��?并且有許多漂浮細(xì)胞，說(shuō)明PSCs的起始密度過(guò)高。在這種情況下，每天更換培養(yǎng)基，每孔加5mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
6、在神經(jīng)誘導(dǎo)的第7天，NSCs(P0)已經(jīng)準(zhǔn)備好收獲和擴(kuò)增傳代。

三、人神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法
準(zhǔn)備神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)擴(kuò)增完全培養(yǎng)基
1、NSC完全培養(yǎng)基需要補(bǔ)充NSC補(bǔ)充劑、L-丙氨酰-谷氨酰胺。
2、在無(wú)菌環(huán)境中，依次將20mL NSC補(bǔ)充劑和5mL 200mML-丙氨酰-谷氨酰胺(abs9295)（2mM終濃度）加入到含有480mL NSC培養(yǎng)基中，此時(shí)即得神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)擴(kuò)增完全培養(yǎng)基(abs9821)。
3、（可選）在培養(yǎng)基中加入10mL/L的抗生素（青霉素-鏈霉素）溶液。

注意：在所有成分的有效期限內(nèi)，在2°C至8°C的黑暗環(huán)境中儲(chǔ)存，可穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)4周。
注意：可選擇添加200μM抗壞血酸，特別是懸浮培養(yǎng)。

包被孔板
1、基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板：取出6孔板/12孔板，每孔內(nèi)加入1mL/0.5mL即用型基質(zhì)膠(abs9410)，輕輕晃動(dòng)6孔板/12孔板使基質(zhì)膠完全覆蓋皿底，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1h-2h，實(shí)驗(yàn)前拿出并置于超凈工作臺(tái)/生物安全柜中室溫下平衡20min。如果暫時(shí)不用，可用Parafilm封口后2-8℃儲(chǔ)存，并于1周內(nèi)使用。
2、在使用前，將已經(jīng)平衡好的即用型基質(zhì)膠棄掉，然后加入預(yù)熱的完全NSC培養(yǎng)基。

NSC傳代
1、當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90-100%的融合度時(shí)，丟棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基。
2、用5mL不含鈣和鎂的預(yù)溫DPBS洗滌細(xì)胞，然后吸棄溶液。
3、在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入1.0mL預(yù)熱的人多能干細(xì)胞消化液(abs9409)，然后在室溫下孵育2-5min。在孵育前確保完全覆蓋細(xì)胞。
4、用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞是否脫離。如有必要，輕拍培養(yǎng)瓶以促進(jìn)細(xì)胞脫離。
5、輕輕上下移液，使團(tuán)塊分散到單個(gè)細(xì)胞懸液中。
6、加入9mL預(yù)熱好的NSC 完全培養(yǎng)基停止細(xì)胞解離反應(yīng)，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中。
7、200×g離心4min。
8、丟棄上清，然后用適量NSC完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。
9、用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定總活細(xì)胞密度。
10、從每個(gè)覆蓋層培養(yǎng)瓶中除去覆蓋層溶液，然后加入5mL預(yù)熱的NSC完全培養(yǎng)基，添加Y27632（終濃度10μM）。
11、在每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入5×10⁴細(xì)胞/cm²(例如，1.25×10⁶細(xì)胞/T-25培養(yǎng)瓶)，然后混合或旋轉(zhuǎn)細(xì)胞懸液以確保均勻分布。
12、于37°C，5%CO₂的潮濕環(huán)境中孵育。
注：為了獲得最佳性能和細(xì)胞生長(zhǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，用新鮮的預(yù)熱的NSC完全培養(yǎng)基。

NSC凍存
1、準(zhǔn)備干細(xì)胞凍存液(abs9412)。
2、按照“NSC傳代”中的步驟1至步驟7收集細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存。
3、在離心過(guò)程中，計(jì)算細(xì)胞密度為2×10⁶個(gè)活細(xì)胞/mL所需的最終體積。
注：接下來(lái)的步驟需要半體積的室溫NSC培養(yǎng)基和半體積的凍存液。
4、丟棄上清，然后用NSC 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
5、加入等量的凍存液，使終濃度為10%DMSO。
6、立即將細(xì)胞懸液等分放入凍存瓶中（1mL/瓶）。
7、按照標(biāo)準(zhǔn)程序（每分鐘降低1°C）在自動(dòng)或手動(dòng)控制速率的冷凍設(shè)備中實(shí)現(xiàn)低溫保存。
8、將冷凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮中。

NSC復(fù)蘇
1、在37°C水浴中迅速(<2min)解凍細(xì)胞。
2、用移液管將凍存液全部移入無(wú)菌的15mL離心管中。
3、小心滴加（每秒1滴），加入4mL預(yù)熱好NSC完全培養(yǎng)基，然后輕輕旋轉(zhuǎn)離心管混合。
4、繼續(xù)添加預(yù)熱的NSC完全培養(yǎng)基至10mL。
5、200×g離心4min，確認(rèn)細(xì)胞沉淀，丟棄上清。
6、加入5mL預(yù)熱好NSC完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，然后添加Y27632（終濃度10μM），再將離心管的全部?jī)?nèi)容物轉(zhuǎn)移到包被的組織培養(yǎng)瓶中。
7、于37°C，5%CO₂的潮濕環(huán)境中孵育。
8、復(fù)蘇后24h用新鮮的預(yù)熱過(guò)的NSC 完全培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。
注：為了恢復(fù)在NSC中生長(zhǎng)的細(xì)胞，我們建議在初始傳代時(shí)以≥1×10⁵個(gè)細(xì)胞/cm²的密度接種細(xì)胞。

四、人神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)形成腦類器官
原代
一、準(zhǔn)備工作
1、儀器設(shè)備
CO₂培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺(tái)、倒置顯微鏡、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、水浴鍋(abs72023)或水浴搖床、醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）。

2、劑耗材（以腸癌為例）
動(dòng)物腦類器官培養(yǎng)基試劑盒(abs90050)、基質(zhì)膠（低因子、無(wú)酚紅）(abs9495)、15mL離心管(abs7102)、1.5mL EP管若干(abs7119)、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(abs7035)、金屬冰盒。

組分名稱	規(guī)格
動(dòng)物腦類器官培養(yǎng)基A	100mL
類器官原代培養(yǎng)緩沖液B	250mL
原代組織消化液C	30mL
類器官傳代消化液D	30mL
組織保存液E	100mL
類器官凍存液F	20mL
類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G	250mL

二、操作流程
1、加膠-點(diǎn)板-加液（這里是整個(gè)原代操作的點(diǎn)睛之筆）
（1）準(zhǔn)備工作
a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過(guò)夜融化；
b 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；
c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。

（2）接種要求
24孔板(abs7035)，每孔25uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度

干細(xì)胞團(tuán)沉淀

消化收集神經(jīng)干細(xì)胞團(tuán)到15mL離心管，于300g 4℃富集離心5min后移去上清。

密度建議1：基質(zhì)膠體積：細(xì)胞團(tuán)沉淀體積=25:1（如果估摸細(xì)胞團(tuán)沉淀體積困難，通常加300uL基質(zhì)膠足夠）

密度建議2：500個(gè)細(xì)胞團(tuán)/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

（4）加膠-點(diǎn)板
向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液
將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基A進(jìn)行培養(yǎng)。大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在200um-500um，可進(jìn)行傳代操作。

鋪板密度

胎羊及胎鼠類器官生長(zhǎng)圖

傳代（消化分兩種情況）
一、類器官數(shù)量較多或體積較大傳代步驟
1、類器官收集及洗滌
1）收集：移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）。

2）洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí)，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說(shuō)明冷化好了）。

3）接下來(lái)將離心管進(jìn)行300g，4℃，離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層），此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液，保留下2/3即可。

促進(jìn)基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：
a 離心機(jī)的選擇非常重要，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類器官分離；
b 離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過(guò)500g），離心時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)（最常不超過(guò)10min）。

2、類器官消化
1）添加2-3mL類器官傳代消化液D于超凈臺(tái)內(nèi)消化2-3min，消化期間吹打1-2次。此步驟以消化成細(xì)胞團(tuán)為主，千萬(wàn)不要消化成單細(xì)胞，單細(xì)胞類器官存活率低。如果不確定是否消化適宜，可吸取數(shù)微升鏡下觀察，如果有較多細(xì)胞團(tuán)可停止消化。

2）添加5倍類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液：消化液=5:1）終止消化，300g 4℃離心5min棄去上清（如果有基質(zhì)膠殘留，殘留量<50uL正常，不影響傳代類器官增殖）

3、加膠-點(diǎn)板-加液
（1）準(zhǔn)備工作
a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過(guò)夜融化；
b 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；
c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。

（2）接種要求
24孔板(abs7035)，每孔25uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度
密度建議1： 類器官通常按1:2傳代，例如，24孔板收集5孔，傳代10孔，需要的基質(zhì)膠量25*10=250uL

密度建議2：500個(gè)細(xì)胞團(tuán)/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是，密度建議2，如果有殘留的基質(zhì)膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點(diǎn)板
向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液
將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL人腸癌類器官培養(yǎng)基 A進(jìn)行培養(yǎng)。大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在200-300um，可進(jìn)行傳代操作。

二、類器官數(shù)量不足或體積較小時(shí)：
1、類器官收集、吹打、洗滌
1）移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠。
2）進(jìn)行吹打，將類器官吹成細(xì)胞團(tuán)（可取樣鏡下觀察有較多細(xì)胞團(tuán)時(shí)可停止吹打）；
3）洗滌： 24孔板，每5孔為一組，收集在15mL離心管中，加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí)，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說(shuō)明冷化好了）。
4）接下來(lái)將離心管進(jìn)行300g，4℃，離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留細(xì)胞團(tuán)沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混懸液層），此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混懸液，保留下2/3即可。

促進(jìn)基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：
a 離心機(jī)的選擇非常重要，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類器官分離；
b 離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過(guò)500g），離心時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)（最常不超過(guò)10min）。

2、加膠-點(diǎn)板-加液
（1）準(zhǔn)備工作
a 基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過(guò)夜融化；
b 槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；
c 融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。

（2）接種要求
24孔板(abs7035)，每孔25uL基質(zhì)膠細(xì)胞團(tuán)混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

（3）接種密度
密度建議1： 對(duì)于類器官數(shù)量較少的情況，為了維持生長(zhǎng)所需的旁分泌信號(hào)，需要2-3孔富集到1孔，例如，24孔板收集6孔，2孔富集1孔，鋪3孔，需要的基質(zhì)膠量25*3=75uL

密度建議2：500個(gè)細(xì)胞團(tuán)/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

注意：不管是按密度建議1還是按密度建議2，如果有殘留的基質(zhì)膠，新膠量至少是殘留膠量的1.5倍

（4）加膠-點(diǎn)板
向細(xì)胞團(tuán)沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

（5）加液
將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基 A進(jìn)行培養(yǎng)。大概7-10天，多數(shù)類器官直徑在200-300um，可進(jìn)行再次傳代。

凍存
凍存要領(lǐng):
類器官不需要消化（消化后的類器官?gòu)?fù)蘇活率低）；
在類器官指數(shù)增長(zhǎng)期凍存（等到該傳代的時(shí)候類器官活性比指數(shù)期差），也就傳代后的Day3-Day4，多數(shù)類器官直徑在100um-200um，這個(gè)時(shí)機(jī)選擇凍存。

一、類器官收集及洗滌
1、收集：移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G，輕柔吹散基質(zhì)膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組）。

2、洗滌：加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G定容至14mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置 40min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，縮短冷凍時(shí)間，摸索合適的冷凍時(shí)間時(shí)，可取出離心管搖晃看不到基質(zhì)膠說(shuō)明冷化好了）。

3、接下來(lái)將離心管進(jìn)行300g，4℃，離心5min，離心完通常會(huì)有這兩種情況：

第一種是正常情況，分成三層（如下圖），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。

第二種是不正常情況，分成兩層（如下圖），這種情況可能與冷化不充分有關(guān)。此時(shí)棄掉緩沖液，留下基質(zhì)膠類器官混懸液，重復(fù)上一步洗滌步驟，再次冷化離心，通常能出現(xiàn)清晰分層（緩沖液層、基質(zhì)膠層、類器官沉淀層），此時(shí)棄掉上清和基質(zhì)膠層，保留類器官沉淀即可。如果依然是兩層（緩沖液層和基質(zhì)膠類器官混懸液層），此時(shí)棄掉緩沖液和上1/3的基質(zhì)膠類器官混懸液，保留下2/3即可。

促進(jìn)基質(zhì)膠和類器官有效分離條件：
a 離心機(jī)的選擇非常重要，水平角離心機(jī)相比固定角離心機(jī)更利于基質(zhì)膠和類器官分離；
b 離心機(jī)的溫度最好是4℃（可避免基質(zhì)膠固化），離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)提高（最高不要超過(guò)500g），離心時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)（最常不超過(guò)10min）。

二、類器官凍存
1、凍存密度，以24孔板為例
密度建議1：2孔/mL凍存液
密度建議2：500個(gè)類器官/mL凍存液（如果想計(jì)數(shù)凍存，可以參照此密度建議）
2、添加適量類器官凍存液F，輕柔吹打重懸，建議立即進(jìn)行凍存。（放置太久，DMSO對(duì)類器官有損傷）
3、梯度凍存：將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過(guò)夜，第二天取出放入液氮罐。
手動(dòng)凍存：4℃冰箱放置30min，轉(zhuǎn)移至-20℃放置1h，然后移至-80℃過(guò)夜，第二天取出放入液氮罐。

復(fù)蘇
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1、將水浴鍋預(yù)熱至37℃；
2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，用預(yù)防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面；
3、在超凈工作臺(tái)中按次序擺好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)板等。

二、取出凍存管
1、根據(jù)類器官凍存記錄按標(biāo)簽找到所需類器官的編號(hào)。
2、從液氮罐中取出凍存盒，取出所需的凍存管，同時(shí)核對(duì)凍存管外的編號(hào)。

三、迅速解凍
1、迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地?fù)u動(dòng)，使管中地液體迅速融化。
2、約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。

四、將類器官凍存液移入15mL離心管，添加10倍體積類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G（緩沖液體積：凍存液體積=10:1）重懸，輕柔吹打混勻，300g 4℃離心5min，棄上清。

五、加膠-點(diǎn)板-加液
1、準(zhǔn)備工作
（1）基質(zhì)膠需用金屬冰盒盛放在4℃冰箱過(guò)夜融化；
（2）槍頭、離心管需要-20℃提前預(yù)冷至少半小時(shí)；
（3）融化后的基質(zhì)膠可一直放4℃儲(chǔ)存，建議2周內(nèi)用完。

2、復(fù)蘇要求
24孔板(abs7035)，每孔25uL基質(zhì)膠類器官混合物，500-750uL類器官培養(yǎng)液

3、復(fù)蘇密度
復(fù)蘇密度建議1：1:1接種（原來(lái)凍幾孔就復(fù)蘇幾孔）
復(fù)蘇密度建議2：250個(gè)類器官/25uL基質(zhì)膠（如果想計(jì)數(shù)接種，可以參照此密度建議）

4、加膠-點(diǎn)板
向類器官沉淀加入基質(zhì)膠(abs9495)，進(jìn)行吹打混勻（不要滿吹滿打，容易產(chǎn)生氣泡），然后進(jìn)行點(diǎn)板。整個(gè)操作在金屬冰盒或冰上進(jìn)行。操作熟練以后，加膠，混勻，點(diǎn)板控制在半分鐘內(nèi)，有利于保持基質(zhì)膠良好的流暢性。

5、加液
將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中40-60min成膠，添加500-750μL類器官培養(yǎng)基A進(jìn)行培養(yǎng)。大概10-14天，多數(shù)類器官直徑在200um-500um，可進(jìn)行傳代操作。

6、腦類器官鑒定圖

今天講解就到這了，大家如有實(shí)驗(yàn)問(wèn)題，歡迎一起交流哦！

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