Innopsys激光共聚焦掃描儀助力結(jié)直腸癌靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)

結(jié)直腸癌（CRC）作為全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率和高死亡率的顯著特征。在腫瘤免疫微環(huán)境中，細(xì)胞因子參與腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的異質(zhì)性相互作用，例如趨化因子CXCL3在多種人類(lèi)癌癥中介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化、侵襲和遷移等過(guò)程促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。另外，髓系來(lái)源抑制性細(xì)胞（MDSCs）是腫瘤免疫微環(huán)境中的重要負(fù)向調(diào)控因子，通過(guò)分泌免疫抑制細(xì)胞因子、產(chǎn)生代謝產(chǎn)物等多種方式抑制 T 細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。然而，腸道微生物群及其代謝物是否通過(guò)細(xì)胞因子、 MDSCs 的積累和功能來(lái)影響結(jié)直腸癌進(jìn)展，相關(guān)研究較為有限，需要進(jìn)行深入探索，為結(jié)直腸癌的臨床治療提供新的科學(xué)依據(jù)和潛在干預(yù)靶點(diǎn)。

文章題目為“Gut microbial metabolite 4-hydroxybenzeneacetic acid drives colorectal cancer progression via accumulation of immunosuppressive PMN-MDSCs”于2025年4月發(fā)表在J Clin Invest雜志，作者來(lái)自于南方醫(yī)科大學(xué)趙亮、丁彥青教授團(tuán)隊(duì)以及廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院王慧教授團(tuán)隊(duì)。

首先作者對(duì)臨床樣本進(jìn)行腸道菌群分析，收集了20例CRC 患者和20例健康對(duì)照（HC）的糞便樣本，通過(guò)糞便宏基因組測(cè)序，分析兩組腸道菌群的α多樣性（Chao1 指數(shù)、Simpson 指數(shù)）、β多樣性（主坐標(biāo)分析 PCoA）及差異菌種（線(xiàn)性判別分析 LEfSe），發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者的腸道微生物多樣性顯著降低，并且特定菌種如具核梭桿菌（F. nucleatum）和大腸桿菌（E. coli）顯著富集。

進(jìn)一步培養(yǎng)人CRC細(xì)胞系（HCT116以及SW480），將細(xì)胞與 E.coli 或 F.nucleatum 共孵育，模擬腸道菌群與腫瘤細(xì)胞的相互作用，隨后使用人細(xì)胞因子芯片檢測(cè)80種不同的細(xì)胞因子和趨化因子。在芯片表面孵育共培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，并加入生物素偶聯(lián)的抗細(xì)胞因子抗體，清洗后加入鏈霉親和素-熒光素（Streptavidin-Fluor）進(jìn)行標(biāo)記，最后使用法國(guó)Innopsys公司的 InnoScan激光共聚焦掃描儀（激發(fā)波長(zhǎng)為 532nm）對(duì)芯片進(jìn)行數(shù)據(jù)采集（如圖1D）。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因（GRO，包括 GROα、GROβ 和 GROγ）、單核細(xì)胞趨化蛋白- 1（MCP-1）、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）以及趨化因子CCL20顯著升高。此外，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行驗(yàn)證（圖1E、F、G），結(jié)果表明變化最為顯著的細(xì)胞因子為巨噬細(xì)胞炎癥蛋白MIP-3α（即 CCL20）和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因GROγ（即 CXCL3）。

圖1：（A）采用 Chao1 指數(shù)和 Simpson 指數(shù)對(duì)結(jié)直腸癌組（CRC 組，n=20）和健康對(duì)照組（HC 組，n=20）進(jìn)行α多樣性分析。（B）在物種水平上對(duì)結(jié)直腸癌組（n=20）和健康對(duì)照組（n=20）進(jìn)行主坐標(biāo)分析（Principal Coordinate Analysis，PCoA）。（C）采用線(xiàn)性判別分析效應(yīng)量法（discriminant analysis effect size，LEfSe）篩選結(jié)直腸癌組（n=20）與健康對(duì)照組（n=20）間的標(biāo)志物種。藍(lán)色柱形和紅色柱形分別代表在結(jié)直腸癌組和健康對(duì)照組中富集的菌群標(biāo)志物種。（D）采用人細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)經(jīng)具核梭桿菌或大腸桿菌處理后的 HCT116 細(xì)胞條件培養(yǎng)基（CM）中炎癥因子的變化情況。方框內(nèi)顯示的是與免疫細(xì)胞趨化相關(guān)的差異細(xì)胞因子，方框下方為細(xì)胞因子芯片韋恩圖。（E、F）實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）分析顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞與具核梭桿菌、大腸桿菌共培養(yǎng) 6 小時(shí)后，細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生變化（n=3）。（G）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞與大腸桿菌、具核梭桿菌共培養(yǎng)后 CCL20 和 CXCL3 的分泌情況（n=5）。*P < 0.05，**P < 0.005，***P < 0.0005。
 

隨后采用高分辨率氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)臨床樣本進(jìn)行代謝物檢測(cè)分析（HRGC-MS），發(fā)現(xiàn)多個(gè)由失調(diào)菌群產(chǎn)生的差異代謝物，包括4-羥基苯乙酸（4-HPA），其能夠顯著上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中CXCL3的表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，4-HPA通過(guò)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，增強(qiáng)STAT3磷酸化，并促進(jìn)其結(jié)合到CXCL3啟動(dòng)子區(qū)域，從而上調(diào)CXCL3的轉(zhuǎn)錄水平。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，喂食4-HPA的小鼠表現(xiàn)出腫瘤內(nèi)PMN-MDSCs數(shù)量顯著增加，同時(shí)CD8+ T細(xì)胞功能受損。而給予綠原酸（CGA）處理后，可有效減少腸道菌群生成4-HPA，緩解免疫抑制狀態(tài)。在臨床晚期結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織中，發(fā)現(xiàn)4-HPA含量明顯升高，并且CXCL3表達(dá)與MDSCs標(biāo)志物呈正相關(guān)，與CD8+ T細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān)。

圖2. 微生物代謝產(chǎn)物 4 - 羥基苯乙酸（4-HPA）介導(dǎo)結(jié)直腸癌（CRC）免疫抑制的示意圖。腸道微生物組以 4 - 羥基苯乙酸（4-HPA）為信使，調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞（CRC 細(xì)胞）中趨化因子 CXCL3 的水平，進(jìn)而控制 CXCR2 陽(yáng)性多形核髓系抑制細(xì)胞（CXCR2⁺ PMN-MDSCs）的聚集。聚集的多形核髓系抑制細(xì)胞（PMN-MDSCs）會(huì)抑制 CD8 陽(yáng)性 T 細(xì)胞（CD8⁺ T 細(xì)胞）的抗腫瘤作用。
 

結(jié)論：作者揭示腸道微生物代謝產(chǎn)物4-HPA通過(guò)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞分泌趨化因子CXCL3，從而招募免疫抑制性的多形核髓源性抑制細(xì)胞（PMN-MDSCs），抑制CD8T細(xì)胞的抗腫瘤活性，最終促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展及免疫抑制微環(huán)境的形成（如上圖2）。

這項(xiàng)研究不僅深化了對(duì)腸道菌群與腫瘤免疫互作機(jī)制的理解，也為未來(lái)的精準(zhǔn)免疫治療提供了潛在靶點(diǎn)。開(kāi)發(fā)特異性抑制4-HPA生成的益生菌或小分子藥物以及靶向阻斷CXCL3與CXCR2之間的信號(hào)傳遞，可考慮納入現(xiàn)有的免疫治療策略，以提高治療療效、延長(zhǎng)患者生存期。

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40179015/

Innopsys 成立于1999年�？偛课挥诜▏�(guó)，一直致力于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相關(guān)儀器和軟件的自主研發(fā)和生產(chǎn)。Innoscan系列掃描儀，采用先進(jìn)的共聚焦PMT檢測(cè)器和多激光掃描光路，可以同時(shí)進(jìn)行多通道熒光檢測(cè)。不僅有效降低了熒光光漂白現(xiàn)象以及信號(hào)損失，還可以有效縮短掃描時(shí)間。在基因組和蛋白組表達(dá)，基因突變，SNP檢測(cè)，CGH，細(xì)菌病毒檢測(cè)，腫瘤特異性標(biāo)志篩查，病理組織篩查等方面都有非常廣泛的應(yīng)用。

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