LAL檢測(cè)的工作原理及在細(xì)菌檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：297　發(fā)布日期：2025-11-4　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

盡管目前有多種方法可用于檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素的存在，但鱟變形細(xì)胞裂解物（Limulus Amebocyte Lysate, LAL）檢測(cè)仍是金標(biāo)準(zhǔn)。鱟（Limulus polyphemus）不僅外形奇特（見圖 1），而且的確來自另一個(gè)時(shí)代——距今 4.5 億年前！它當(dāng)之無愧地被稱為“活化石”。

圖 1：鱟（Limulus polyphemus）

醫(yī)學(xué)界對(duì)鱟血的興趣主要源于其中存在的變形細(xì)胞（amebocytes）。這些細(xì)胞在鱟的生存中至關(guān)重要，是其抵御真菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的先天免疫關(guān)鍵。變形細(xì)胞內(nèi)含有一種名為凝固原（coagulogen）的凝血因子。當(dāng)它們接觸到存在于入侵細(xì)菌細(xì)胞壁中的細(xì)菌內(nèi)毒素時(shí)，凝固原會(huì)被釋放并觸發(fā)一系列酶促反應(yīng)，最終導(dǎo)致凝固（凝塊或膠化）、固定并中和病原體。凝血反應(yīng)的起始點(diǎn)是凝血因子 C¹。這一特性可被用于檢測(cè)需符合特定安全標(biāo)準(zhǔn)的注射類（靜脈給藥）藥物。

LAL檢測(cè)的工作原理

變形細(xì)胞在檢測(cè)到細(xì)菌內(nèi)毒素時(shí)產(chǎn)生可見反應(yīng)的能力，是 LAL 檢測(cè)的基礎(chǔ)。LAL 檢測(cè)基于從鱟血中分離出的變形細(xì)胞裂解物（LAL）提取物¹。LAL 檢測(cè)主要有三種基本方法：凝膠凝塊法、顯色法和濁度法。

01 凝膠凝塊法

凝膠凝塊法是最初期且最簡單的 LAL 檢測(cè)方法。這是一種定性檢測(cè)，通過肉眼觀察樣品管底部是否形成凝塊或凝膠來判斷樣品中是否存在內(nèi)毒素。

02 顯色法

顯色 LAL 檢測(cè)是一種定量檢測(cè)，其原理是：當(dāng)樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素激活鱟凝血因子 C 時(shí)，會(huì)觸發(fā)酶促反應(yīng)，產(chǎn)生黃色（顯色）（見圖 2）。在試劑盒的特定檢測(cè)范圍內(nèi)，顏色的強(qiáng)度與樣品中污染物的含量成正比——內(nèi)毒素越多，溶液的黃色越深。顯色反應(yīng)可通過分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度進(jìn)行定量（通常以 EU/mL 或 EU/樣品表示）。

圖 2：顯色 LAL 檢測(cè)的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)。鱟凝血因子 C 是反應(yīng)的起點(diǎn)，最終產(chǎn)生黃色。

顯色 LAL 檢測(cè)的動(dòng)力學(xué)變體通過測(cè)量在加入底物后顯色反應(yīng)開始的時(shí)間，并基于標(biāo)準(zhǔn)曲線插值來計(jì)算未知樣品的內(nèi)毒素含量（見圖 3）。

圖 3：動(dòng)力學(xué)顯色 LAL 檢測(cè)的信號(hào)曲線

尤其在使用酶標(biāo)儀進(jìn)行定量時(shí)，顯色 LAL 檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)包括可提高效率和檢測(cè)通量，并且便于自動(dòng)化。

03 濁度法

當(dāng)樣品本身帶有顏色，可能干擾顯色 LAL 檢測(cè)的黃色讀數(shù)時(shí)，通常會(huì)使用 LAL 濁度法。在這種情況下，利用 LAL 凝血產(chǎn)生顆粒，使溶液變得渾濁，然后檢測(cè)其濁度。這種方法的檢測(cè)結(jié)果不會(huì)受樣品本身顏色影響。

在酶標(biāo)儀上進(jìn)行LAL測(cè)試

顯色法和濁度 LAL 測(cè)試均可使用酶標(biāo)儀進(jìn)行定量。這些方法非常簡單，只需使用吸收光酶標(biāo)儀在 405-410 nm 波長下探測(cè)發(fā)色 LAL 反應(yīng)的黃色出現(xiàn)，或在 340 nm 波長下探測(cè) LAL 透射比濁法測(cè)定法的濁度變化。

所有配備吸收功能的 BMG LABTECH 酶標(biāo)儀均可讀取 LAL 測(cè)定結(jié)果。這些酶標(biāo)儀包括 SPECTROstar Nano、Omega 系列、VANTAstar、CLARIOstar Plus 和 PHERAstar FSX。

MARS 數(shù)據(jù)分析軟件也可用于進(jìn)行動(dòng)力學(xué)計(jì)算。對(duì)于此測(cè)試，比較每個(gè)樣品達(dá)到特定 OD 閾值所需的時(shí)間非常重要，該時(shí)間用于比較已知濃度的樣品，并創(chuàng)建用于計(jì)算未知值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

應(yīng)用說明“Lonza 使用 BMG LABTECH 酶標(biāo)儀和 MARS 數(shù)據(jù)分析進(jìn)行內(nèi)毒素探測(cè)的動(dòng)力學(xué)試劑盒”提供了在酶標(biāo)儀上運(yùn)行顯色 LAL 檢測(cè)的示例。（點(diǎn)擊“閱讀原文”可在官網(wǎng)獲�。�

LAL檢測(cè)與動(dòng)物福利

不幸的是，LAL 的生產(chǎn)依賴于一種相對(duì)粗放的方式——捕捉鱟（2015 年超過 50 萬只），以采集少量血液（見圖 4）。雖然采血后鱟可以被釋放，但已知仍有約 10–30% 在運(yùn)輸和/或采血過程中死亡。

圖 4：在采血設(shè)施中被采血的鱟²

LAL替代方案

來自新加坡鱟的重組凝血因子 C 蛋白（rFC）已被克隆，作為潛在的“合成”LAL 替代品³。對(duì) rFC 底物 B 因子的切割位點(diǎn)的了解，使得基于重組蛋白的檢測(cè)（稱為 rFC 檢測(cè)）得以開發(fā)。rFC 檢測(cè)的前景較好，因?yàn)樗?LAL 更敏感，且對(duì)內(nèi)毒素的特異性更高²。

另一種替代方法是單核細(xì)胞活化試驗(yàn)（MAT），這是一種體外細(xì)胞檢測(cè)方法，通過檢測(cè)單核細(xì)胞在內(nèi)毒素驅(qū)動(dòng)下釋放的細(xì)胞因子來判斷內(nèi)毒素存在，通常結(jié)合 ELISA 檢測(cè)，原理基于單核細(xì)胞對(duì)病原體的先天免疫反應(yīng)。

References

Iwanaga S. Biochemical principle of Limulus test for detecting bacterial endotoxins. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2007 May;83(4):110-9. doi: 10.2183/pjab.83.110. PMID: 24019589; PMCID: PMC3756735.
Maloney T, Phelan R, Simmons N (2018) Saving the horseshoe crab: A synthetic alternative to horseshoe crab blood for endotoxin detection. PLOS Biology 16(10): e2006607.
Ding JL, Navas MA 3rd, Ho B. Molecular cloning and sequence analysis of factor C cDNA from the Singapore horseshoe crab, Carcinoscorpius rotundicauda. Mol Mar Biol Biotechnol. 1995 Mar;4(1):90-103. PMID: 7538401.

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