蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)：定量方法及原理
定量蛋白質(zhì)組學(xué)旨在對生物體、組織、細(xì)胞等樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，研究其在不同生理病理狀態(tài)、不同發(fā)育階段或不同環(huán)境條件下的表達(dá)水平變化，以深入了解蛋白質(zhì)功能、揭示生命活動規(guī)律和疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制�；谫|(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)定量目前已成為主流方法，在標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和驗證研究中發(fā)揮重要作用。本期推送我們就來為大家介紹一下常用的幾種定量方法。
質(zhì)譜蛋白質(zhì)組定量方法可分為非標(biāo)記定量、標(biāo)記定量和靶向定量三個大類。非標(biāo)記定量包括 DDA和DIA，前者依據(jù)一級質(zhì)譜峰面積定量，但低豐度蛋白易漏檢；后者對選定質(zhì)荷比范圍內(nèi)的所有離子同時碎裂和掃描，并且基于MS2完成定性和定量，更準(zhǔn)確、重現(xiàn)性更好。標(biāo)記定量包括基于 MS2/MS3 報告離子定量的 TMT和iTRAQ，可同時標(biāo)記多個樣本，還有基于MS1代謝標(biāo)記定量的 SILAC，僅適用于體外培養(yǎng)細(xì)胞樣本。前述定量方法均用來在復(fù)雜樣本的全蛋白組中篩選潛在差異表達(dá)蛋白，而靶向定量的MRM和PRM 則針對特定蛋白質(zhì)或肽段進(jìn)行掃描和定量分析，特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，適用于后期標(biāo)志物驗證。
01.非標(biāo)記定量
DDA和DIA都屬于非標(biāo)記定量(LFQ)，無需對蛋白質(zhì)進(jìn)行額外標(biāo)記，主要依據(jù)質(zhì)譜檢測到的信號強(qiáng)度或峰面積來推斷蛋白質(zhì)含量。該方法實驗操作相對簡便，能避免標(biāo)記過程引入的偏差，不受標(biāo)記數(shù)量的限制，適用于大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究，但容易受到質(zhì)譜分析過程中的各種因素影響，需做好嚴(yán)格的質(zhì)控。
圖1 DDA和DIA采集原理示意[1]
1.1 DDA(數(shù)據(jù)依賴型采集）
DDA是最常用的非標(biāo)記定量方法之一，主要通過比較不同樣本中相同蛋白質(zhì)的一級質(zhì)譜峰強(qiáng)度或峰面積來實現(xiàn)。PEAKS軟件的DDA LFQ定量是基于肽段特征峰(Peptide feature)面積的，feature指的是同一肽段的所有同位素峰(圖2)。通過對比不同樣本間定量值的高低判定其相對含量(圖3)。蛋白定量值默認(rèn)使用打分top 3的unique肽段定量值加和，在某些樣本中的定量值高則表明在該樣本中的表達(dá)量相對較高。
圖2 peptide feature示例
圖3 同一肽段在不同樣本間的特征峰分布
DDA的實驗和數(shù)據(jù)分析相對比較容易，并且適合未知的翻譯后修飾和潛在突變位點(diǎn)分析，成本低，不過也存在一定局限性。由于其是基于信號強(qiáng)度選擇母離子進(jìn)行二級碎裂，低豐度肽段的母離子可能因信號響應(yīng)過低而無法被選中，導(dǎo)致定量缺失，影響蛋白質(zhì)定量的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。
1.2 DIA(數(shù)據(jù)非依賴型采集)
DIA技術(shù)是為克服DDA的局限性而發(fā)展起來的。在DIA掃描模式下，儀器不再選擇性地對特定離子進(jìn)行碎裂，而是對選定質(zhì)荷比范圍內(nèi)的所有離子同時進(jìn)行碎裂和掃描。常規(guī)DIA方法是將整個質(zhì)譜掃描范圍劃分為多個連續(xù)的窗口，依次對每個窗口內(nèi)的離子進(jìn)行碎裂和MS2掃描，獲得所有離子的二級譜。DIA的優(yōu)勢在于能夠無遺漏、無偏差地檢測樣本中的所有離子，定性和定量均基于二級譜完成，蛋白定量不是簡單的肽段定量值的加和，而是采用最小二乘法，將所有肽段納入計算（圖4）。
圖4 DIA定量邏輯[2]
DIA比DDA定量結(jié)果更準(zhǔn)確、重復(fù)性更好，尤其適用于復(fù)雜樣本的深度蛋白質(zhì)組定性和定量分析。但DIA數(shù)據(jù)的譜圖極為復(fù)雜，因此對分析軟件和算法的要求也就更高。PEAKS Studio和PEAKS Online支持DIA數(shù)據(jù)的定性和定量分析，并且全面兼容譜圖庫搜索(spectral library)、直接數(shù)據(jù)庫搜索(DIA database search)和DIA de novo，根據(jù)分析需求直接選擇相應(yīng)的分析工作流即可(圖5)。
圖5 PEAKS中的DIA數(shù)據(jù)分析工作流
圖6 報告離子定量示意
報告離子定量技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是能夠同時對多個樣本(TMT最多可同時標(biāo)記18個樣本，iTRAQ通常可標(biāo)記4-8個樣本)進(jìn)行定量分析，通量高，靈敏度也較好。然而，標(biāo)記過程較為繁瑣，成本相對較高。
2.2 基于MS1的代謝標(biāo)記定量
穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用(SILAC)是典型的基于MS1的代謝標(biāo)記定量方法。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基中添加含有穩(wěn)定同位素(如13C、15N等)標(biāo)記的必需氨基酸(如精氨酸、賴氨酸)。細(xì)胞在生長代謝過程中，會將這些標(biāo)記的氨基酸整合到新合成的蛋白質(zhì)中。經(jīng)過多代培養(yǎng)后，細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)幾乎都被穩(wěn)定同位素標(biāo)記。將標(biāo)記細(xì)胞與未標(biāo)記細(xì)胞(對照組)的蛋白質(zhì)提取物混合，進(jìn)行質(zhì)譜分析。在MS1掃描時，由于標(biāo)記和未標(biāo)記蛋白質(zhì)含有不同質(zhì)量的氨基酸，它們的質(zhì)荷比會出現(xiàn)差異，形成具有特定質(zhì)量差的峰對。通過比較這些峰對的強(qiáng)度，就可以準(zhǔn)確計算出標(biāo)記樣本和未標(biāo)記樣本中蛋白質(zhì)的相對含量(圖7)。
圖7 SILAC定量示意
SILAC的優(yōu)勢在于標(biāo)記過程在細(xì)胞培養(yǎng)階段完成，標(biāo)記均勻且對蛋白質(zhì)的后續(xù)處理影響較小，定量準(zhǔn)確性高。但該方法標(biāo)記通道有限，僅適用于能夠在體外培養(yǎng)的細(xì)胞樣本，對于組織樣本或難以培養(yǎng)的細(xì)胞則無法使用，應(yīng)用范圍存在一定限制，標(biāo)記周期長，試劑成本也有所增加。
03.靶向定量
質(zhì)譜蛋白質(zhì)組定量方法可分為非標(biāo)記定量、標(biāo)記定量和靶向定量三個大類。非標(biāo)記定量包括 DDA和DIA，前者依據(jù)一級質(zhì)譜峰面積定量，但低豐度蛋白易漏檢；后者對選定質(zhì)荷比范圍內(nèi)的所有離子同時碎裂和掃描，并且基于MS2完成定性和定量，更準(zhǔn)確、重現(xiàn)性更好。標(biāo)記定量包括基于 MS2/MS3 報告離子定量的 TMT和iTRAQ，可同時標(biāo)記多個樣本，還有基于MS1代謝標(biāo)記定量的 SILAC，僅適用于體外培養(yǎng)細(xì)胞樣本。前述定量方法均用來在復(fù)雜樣本的全蛋白組中篩選潛在差異表達(dá)蛋白，而靶向定量的MRM和PRM 則針對特定蛋白質(zhì)或肽段進(jìn)行掃描和定量分析，特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，適用于后期標(biāo)志物驗證。
01.非標(biāo)記定量
DDA和DIA都屬于非標(biāo)記定量(LFQ)，無需對蛋白質(zhì)進(jìn)行額外標(biāo)記，主要依據(jù)質(zhì)譜檢測到的信號強(qiáng)度或峰面積來推斷蛋白質(zhì)含量。該方法實驗操作相對簡便，能避免標(biāo)記過程引入的偏差，不受標(biāo)記數(shù)量的限制，適用于大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)研究，但容易受到質(zhì)譜分析過程中的各種因素影響，需做好嚴(yán)格的質(zhì)控。
圖1 DDA和DIA采集原理示意[1]
1.1 DDA(數(shù)據(jù)依賴型采集）
DDA是最常用的非標(biāo)記定量方法之一，主要通過比較不同樣本中相同蛋白質(zhì)的一級質(zhì)譜峰強(qiáng)度或峰面積來實現(xiàn)。PEAKS軟件的DDA LFQ定量是基于肽段特征峰(Peptide feature)面積的，feature指的是同一肽段的所有同位素峰(圖2)。通過對比不同樣本間定量值的高低判定其相對含量(圖3)。蛋白定量值默認(rèn)使用打分top 3的unique肽段定量值加和，在某些樣本中的定量值高則表明在該樣本中的表達(dá)量相對較高。
圖2 peptide feature示例圖3 同一肽段在不同樣本間的特征峰分布DDA的實驗和數(shù)據(jù)分析相對比較容易，并且適合未知的翻譯后修飾和潛在突變位點(diǎn)分析，成本低，不過也存在一定局限性。由于其是基于信號強(qiáng)度選擇母離子進(jìn)行二級碎裂，低豐度肽段的母離子可能因信號響應(yīng)過低而無法被選中，導(dǎo)致定量缺失，影響蛋白質(zhì)定量的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。
1.2 DIA(數(shù)據(jù)非依賴型采集)
DIA技術(shù)是為克服DDA的局限性而發(fā)展起來的。在DIA掃描模式下，儀器不再選擇性地對特定離子進(jìn)行碎裂，而是對選定質(zhì)荷比范圍內(nèi)的所有離子同時進(jìn)行碎裂和掃描。常規(guī)DIA方法是將整個質(zhì)譜掃描范圍劃分為多個連續(xù)的窗口，依次對每個窗口內(nèi)的離子進(jìn)行碎裂和MS2掃描，獲得所有離子的二級譜。DIA的優(yōu)勢在于能夠無遺漏、無偏差地檢測樣本中的所有離子，定性和定量均基于二級譜完成，蛋白定量不是簡單的肽段定量值的加和，而是采用最小二乘法，將所有肽段納入計算（圖4）。
圖4 DIA定量邏輯[2]
DIA比DDA定量結(jié)果更準(zhǔn)確、重復(fù)性更好，尤其適用于復(fù)雜樣本的深度蛋白質(zhì)組定性和定量分析。但DIA數(shù)據(jù)的譜圖極為復(fù)雜，因此對分析軟件和算法的要求也就更高。PEAKS Studio和PEAKS Online支持DIA數(shù)據(jù)的定性和定量分析，并且全面兼容譜圖庫搜索(spectral library)、直接數(shù)據(jù)庫搜索(DIA database search)和DIA de novo，根據(jù)分析需求直接選擇相應(yīng)的分析工作流即可(圖5)。
圖5 PEAKS中的DIA數(shù)據(jù)分析工作流
02.標(biāo)記定量
標(biāo)記定量是通過對蛋白質(zhì)或肽段進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記，使不同樣本中的蛋白質(zhì)帶有可區(qū)分的標(biāo)記物，從而在質(zhì)譜檢測時更精準(zhǔn)地進(jìn)行定量分析。該方法能有效提高定量的準(zhǔn)確性和靈敏度，減少樣本間的誤差。
2.1 基于MS2/MS3的報告離子定量
常用的基于MS2/MS3報告離子定量技術(shù)有TMT和iTRAQ。TMT和iTRAQ試劑均由報告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和反應(yīng)基團(tuán)組成。反應(yīng)基團(tuán)可與蛋白質(zhì)或肽段的特定基團(tuán)(如賴氨酸殘基的氨基)發(fā)生共價結(jié)合，實現(xiàn)標(biāo)記。標(biāo)記后的不同樣本混合進(jìn)行質(zhì)譜分析。在MS1掃描時，由于標(biāo)記后的肽段帶有相同質(zhì)量的標(biāo)簽，所以具有相同的質(zhì)荷比，無法區(qū)分不同樣本來源的肽段。但在MS2掃描時，肽段發(fā)生碎裂，報告基團(tuán)從標(biāo)簽上脫落，產(chǎn)生具有特征質(zhì)量的報告離子。不同樣本的報告離子質(zhì)量不同，通過檢測這些報告離子的強(qiáng)度，就能計算出不同樣本中相應(yīng)蛋白質(zhì)的相對含量(圖6)。部分情況下，還可以進(jìn)行TMT MS3掃描，進(jìn)一步提高定量的準(zhǔn)確性，減少干擾。
標(biāo)記定量是通過對蛋白質(zhì)或肽段進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記，使不同樣本中的蛋白質(zhì)帶有可區(qū)分的標(biāo)記物，從而在質(zhì)譜檢測時更精準(zhǔn)地進(jìn)行定量分析。該方法能有效提高定量的準(zhǔn)確性和靈敏度，減少樣本間的誤差。
2.1 基于MS2/MS3的報告離子定量
常用的基于MS2/MS3報告離子定量技術(shù)有TMT和iTRAQ。TMT和iTRAQ試劑均由報告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和反應(yīng)基團(tuán)組成。反應(yīng)基團(tuán)可與蛋白質(zhì)或肽段的特定基團(tuán)(如賴氨酸殘基的氨基)發(fā)生共價結(jié)合，實現(xiàn)標(biāo)記。標(biāo)記后的不同樣本混合進(jìn)行質(zhì)譜分析。在MS1掃描時，由于標(biāo)記后的肽段帶有相同質(zhì)量的標(biāo)簽，所以具有相同的質(zhì)荷比，無法區(qū)分不同樣本來源的肽段。但在MS2掃描時，肽段發(fā)生碎裂，報告基團(tuán)從標(biāo)簽上脫落，產(chǎn)生具有特征質(zhì)量的報告離子。不同樣本的報告離子質(zhì)量不同，通過檢測這些報告離子的強(qiáng)度，就能計算出不同樣本中相應(yīng)蛋白質(zhì)的相對含量(圖6)。部分情況下，還可以進(jìn)行TMT MS3掃描，進(jìn)一步提高定量的準(zhǔn)確性，減少干擾。
圖6 報告離子定量示意
報告離子定量技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是能夠同時對多個樣本(TMT最多可同時標(biāo)記18個樣本，iTRAQ通常可標(biāo)記4-8個樣本)進(jìn)行定量分析，通量高，靈敏度也較好。然而，標(biāo)記過程較為繁瑣，成本相對較高。
2.2 基于MS1的代謝標(biāo)記定量
穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用(SILAC)是典型的基于MS1的代謝標(biāo)記定量方法。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基中添加含有穩(wěn)定同位素(如13C、15N等)標(biāo)記的必需氨基酸(如精氨酸、賴氨酸)。細(xì)胞在生長代謝過程中，會將這些標(biāo)記的氨基酸整合到新合成的蛋白質(zhì)中。經(jīng)過多代培養(yǎng)后，細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)幾乎都被穩(wěn)定同位素標(biāo)記。將標(biāo)記細(xì)胞與未標(biāo)記細(xì)胞(對照組)的蛋白質(zhì)提取物混合，進(jìn)行質(zhì)譜分析。在MS1掃描時，由于標(biāo)記和未標(biāo)記蛋白質(zhì)含有不同質(zhì)量的氨基酸，它們的質(zhì)荷比會出現(xiàn)差異，形成具有特定質(zhì)量差的峰對。通過比較這些峰對的強(qiáng)度，就可以準(zhǔn)確計算出標(biāo)記樣本和未標(biāo)記樣本中蛋白質(zhì)的相對含量(圖7)。
圖7 SILAC定量示意
SILAC的優(yōu)勢在于標(biāo)記過程在細(xì)胞培養(yǎng)階段完成，標(biāo)記均勻且對蛋白質(zhì)的后續(xù)處理影響較小，定量準(zhǔn)確性高。但該方法標(biāo)記通道有限，僅適用于能夠在體外培養(yǎng)的細(xì)胞樣本，對于組織樣本或難以培養(yǎng)的細(xì)胞則無法使用，應(yīng)用范圍存在一定限制，標(biāo)記周期長，試劑成本也有所增加。
03.靶向定量
靶向定量是對預(yù)先設(shè)定的特定母離子進(jìn)行定量分析，具有高靈敏度、高特異性和準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的潛在生物標(biāo)志物驗證的重要方法。如圖8A所示，多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)及平行反應(yīng)監(jiān)測(PRM)是常用的靶向定量方法。在MRM模式下，儀器首先選擇目標(biāo)肽段的母離子(特定質(zhì)荷比的離子)進(jìn)行檢測(Q1選擇)，母離子在碰撞室中碎裂后，儀器再選擇特定的碎片離子(Q3選擇)進(jìn)行監(jiān)測。通過監(jiān)測母離子到特定碎片離子的反應(yīng)，能夠特異性地檢測目標(biāo)肽段，排除其他干擾。PRM技術(shù)則是在MRM基礎(chǔ)上發(fā)展而來，它利用高分辨率質(zhì)譜，能夠同時監(jiān)測多個目標(biāo)肽段的所有碎片離子，獲得更全面的信息，提高定量的準(zhǔn)確性和可靠性(圖8B)。靶向定量需要預(yù)先了解目標(biāo)肽段母離子的信息，如氨基酸序列、m/z等，通過針對性地優(yōu)化檢測條件，實現(xiàn)對目標(biāo)肽段和蛋白的精確定量。
圖8 靶向定量示意
04.參考文獻(xiàn)
[1]. Guo J, Huan T. Comparison of Full-Scan, Data-Dependent, and Data-Independent Acquisition Modes in Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Based Untargeted Metabolomics. Anal Chem. 2020 Jun 16;92(12):8072-8080. doi: 10.1021/acs.analchem.9b05135. Epub 2020 May 27. PMID: 32401506.
[2].Cox J, Hein MY, Luber CA, Paron I, Nagaraj N, Mann M. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Mol Cell Proteomics. 2014 Sep;13(9):2513-26. doi: 10.1074/mcp.M113.031591. Epub 2014 Jun 17. PMID: 24942700; PMCID: PMC4159666.
作為生物信息學(xué)的領(lǐng)軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物藥領(lǐng)域，通過機(jī)器學(xué)習(xí)和先進(jìn)算法提供世界領(lǐng)先的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)解決方案，以推進(jìn)生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)的卓越洞見。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學(xué)術(shù)和工業(yè)用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務(wù)和抗體綜合表征服務(wù)等。聯(lián)系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
[1]. Guo J, Huan T. Comparison of Full-Scan, Data-Dependent, and Data-Independent Acquisition Modes in Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Based Untargeted Metabolomics. Anal Chem. 2020 Jun 16;92(12):8072-8080. doi: 10.1021/acs.analchem.9b05135. Epub 2020 May 27. PMID: 32401506.
[2].Cox J, Hein MY, Luber CA, Paron I, Nagaraj N, Mann M. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Mol Cell Proteomics. 2014 Sep;13(9):2513-26. doi: 10.1074/mcp.M113.031591. Epub 2014 Jun 17. PMID: 24942700; PMCID: PMC4159666.
作為生物信息學(xué)的領(lǐng)軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物藥領(lǐng)域，通過機(jī)器學(xué)習(xí)和先進(jìn)算法提供世界領(lǐng)先的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)解決方案，以推進(jìn)生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)的卓越洞見。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學(xué)術(shù)和工業(yè)用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務(wù)和抗體綜合表征服務(wù)等。聯(lián)系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
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