凝膠過濾層析選擇三步法及實驗優(yōu)化小技巧
凝膠過濾層析是一種基于樣品和雜質(zhì)分子大小差異實現(xiàn)分離純化的經(jīng)典而高效的層析技術。雖然凝膠過濾層析分辨率較高，面對難以分離的雜質(zhì)經(jīng)過適當?shù)膬?yōu)化往往可以達到更高的純度。接下來，小優(yōu)就帶大家看看有哪些優(yōu)化的小技巧吧。
1、凝膠過濾層析選擇三步法
想要達到盡可能高的分辨率，選擇合適的產(chǎn)品非常重要。凝膠過濾層析的選擇可以按照三步策略：選擇合適的分離范圍，使用合適的上樣量，以及盡可能選擇粒徑較小的層析柱。
（1）選擇合適的分離范圍
在購買層析柱或者選擇實驗室已有的層析柱時，首先應關注層析柱適合的分離范圍。例如下圖所示，不同的層析柱適合的蛋白分離范圍也有差別，表明層析柱在這個分子量范圍內(nèi)具有最佳的分離效果。目標蛋白的分子量應在層析柱的分離范圍內(nèi)，如果多個層析柱分離范圍有重疊，則目標蛋白的分子量在分離范圍靠近中間較好。
Superdex™ 預裝柱高分辨率優(yōu)選半制備純化
| 產(chǎn)品代碼 | 產(chǎn)品 | 內(nèi)徑x床高(mm) | 柱體積(mL) | 平均顆粒(ym) | 球蛋白分離范圍(Da) | 應用/特性 | 耐壓(MPa) | 最高流速(mL/min) |
| 29219757 | Superdex™ 30 Increase 10/300 GL | 10/300 | 24 | 9.0 | 100-7,000 | 肽及其他小分子的半制備和高性能分析純化 | 3.0 | 1.2 |
| 29148721 | Superdex™ 75 Increase 10/300 GL | 10/300 | 24 | 3,000-70,000 | 蛋白、肽、核甘酸及其它小分子的半制備和高性能分析純化 | 1.6 | ||
| 29148722 | Superdex™75 Increase 5/150 GL | 5/150 | 3 | 3,000-70,000 | 0.75 | |||
| 28990944 | Superdex™ 200 increase 10/300 GL | 10/300 | 24 | 8.6 | 10,000-600,000 | 蛋白、DNA 片段及其它小分子的半制備和高性能分析純化 | 1.8 | |
| 28990945 | Superdex™ 200 Increase 5/150 GL | 5/150 | 3 | 10,000-600,000 | 0.75 |
（2）使用的合適的上樣量
凝膠過濾層析對上樣量有限制，根據(jù)實驗目的的不同，Cytiva也為客戶提供多種不同規(guī)格的層析柱。普通的10/300的柱型，柱體積是24ml，上樣量最大為500ul；3.2/300和5/150柱型則適合于更小的上樣量；如果上樣量較大，也可以選擇120ml和320ml的Hiload柱型，最大可上樣13ml。
（3）盡可能選擇粒徑較小的層析柱
在購買和選擇層析柱時，每個層析柱都會標明里面填充的凝膠小球的粒徑。粒徑較大的凝膠小球流速快，反壓小，但通常分辨率不高。如果想要達到較高的純度，應盡可能選擇粒徑較小的層析柱。如下圖，Superdex Increase系列粒徑為9um，是高分辨率的優(yōu)選。
Superdex™ 預裝柱高分辨率優(yōu)選半制備純化
| 產(chǎn)品代碼 | 產(chǎn)品 | 內(nèi)徑x床高(mm) | 柱體積(mL) | 平均顆粒(ym) | 球蛋白分離范圍(Da) | 應用/特性 | 耐壓(MPa) | 最高流速(mL/min) |
| 29219757 | Superdex™ 30 Increase 10/300 GL | 10/300 | 24 | 9.0 | 100-7,000 | 肽及其他小分子的半制備和高性能分析純化 | 3.0 | 1.2 |
| 29148721 | Superdex™ 75 Increase 10/300 GL | 10/300 | 24 | 3,000-70,000 | 蛋白、肽、核甘酸及其它小分子的半制備和高性能分析純化 | 1.6 | ||
| 29148722 | Superdex™75 Increase 5/150 GL | 5/150 | 3 | 3,000-70,000 | 0.75 | |||
| 28990944 | Superdex™ 200 increase 10/300 GL | 10/300 | 24 | 8.6 | 10,000-600,000 | 蛋白、DNA 片段及其它小分子的半制備和高性能分析純化 | 1.8 | |
| 28990945 | Superdex™ 200 Increase 5/150 GL | 5/150 | 3 | 10,000-600,000 | 0.75 |
2、凝膠過濾層析二倍原則
凝膠過濾層析當目標蛋白和雜蛋白分子量相差1倍以上時，可以得到較高的分離效果。如果目標蛋白和雜蛋白分子量相差不大，也可以考慮使用離子交換等其他層析技術進行分離。
3、柱高的優(yōu)化
凝膠過濾層析在分離時需要有較長的路徑，因此柱高越長，分離效果會越好。一般柱高增加一倍，分辨率可以提高約40%。因此，如果是出于分離目標蛋白和雜蛋白的目的，應選擇較長的10/300的柱子，5/150的柱子更適合于做快速篩選。
如果選擇空柱自己填裝，也應在確定柱體積的情況下，盡可能選擇直徑較小，柱高較長的“細長型”的柱子，可以達到更高的分辨率。
如果實驗室沒有較長的層析柱，也可以選擇將兩個層析柱串聯(lián)使用，以提高純度。
4、運行流速的優(yōu)化
在不改變層析柱的情況下，如果想盡可能提高純度，可以適當降低流速。有數(shù)據(jù)表明，降低運行流速有利于提高分辨率，但也會增加時間成本。初次實驗可以參考說明書上的推薦流速進行。此外，如果樣品粘度較高，或者在低溫時運行實驗時，應適當降低流速。
5、樣品上樣體積的優(yōu)化
在不改變層析柱的情況下，如果想盡可能提高純度，可以適當減少上樣體積。有數(shù)據(jù)表明，較少上樣體積有利于提高分辨率，凝膠過濾層析柱的上樣量通常建議為層析柱柱體積的2%-5%，如果樣品量較大，可以使用超濾管進行樣品濃縮后再上樣。
6、填料裝填效果的優(yōu)化
層析柱中填料的裝填效果對分辨率也會產(chǎn)生較大的影響。Cytiva的預裝柱在出廠前已經(jīng)進行了柱效測定，具有嚴格的出廠柱效標準。如果是自己填裝的層析柱，通過直接觀察很難觀察出填料裝填的好壞，因此需要進行柱效測定。填料排列不整齊，或者填料大小不均一，或者填料有破碎，都會極大的損害到分離效果。柱效檢測的方法可以參考操作視頻：https://www.univ-bio.com/article/id-7650.html。如果柱效不佳，可以考慮重新填裝柱子，并且在購買填料時，應盡可能選擇粒徑均一，沒有破碎的優(yōu)質(zhì)填料。
層析柱經(jīng)過一段時間的使用，如果發(fā)生堵塞，超壓等不良使用的情況，也可能造成柱效降低，此時也可以通過柱效檢測的方法重新進行柱效檢測。
部分凝膠過濾層析熱賣產(chǎn)品
部分熱賣針式過濾器
| 貨號 | 品名 | 規(guī)格 |
| 29148721 | Superdex 75 Increase 10/300 GL | 10 x 300 mm |
| 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL | 10 x 300 mm |
| 29219757 | Superdex 30 Increase 10/300 GL | 10 x 300 mm |
| 28990945 | Superdex 200 Increase 5/150 GL | 5 x 150 mm |
| 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL | 10 x 300 mm |
| 29091598 | Superose 6 Increase 3.2/300 | 3.2 x 300 mm |
| 28989333 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | 16 x 600 mm |
| 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | 26 x 600 mm |
| 28989334 | HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | 26 x 600 mm |
| 28989336 | HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | 26 x 600 mm |
| 17104401 | superdex 75 pg | 150ml |
| 17104301 | superdex 200 pg | 150ml |
| 17059901 | Sephacryl S-300 HR | 750ml |
| 17058410 | Sephacryl S-200 HR | 150ml |
部分熱賣針式過濾器
| 貨號 | 名稱 | 濾膜材質(zhì) | 孔徑 | 規(guī)格 |
| abs7294-1盒 | 33mm針式過濾器 | PES | 0.2um | 50個 |
| abs7295-1盒 | 33mm針式過濾器 | PES | 0.45um | 50個 |
| abs7294-1箱 | 33mm針式過濾器 | PES | 0.2um | 500個 |
| abs7295-1箱 | 33mm針式過濾器 | PES | 0.45um | 500個 |
| abs7290-1盒 | 33mm針式過濾器 | PVDF | 0.2um | 50個 |
| abs7291-1盒 | 33mm針式過濾器 | PVDF | 0.45um | 50個 |
| abs7290-1箱 | 33mm針式過濾器 | PVDF | 0.2um | 500個 |
| abs7291-1箱 | 33mm針式過濾器 | PVDF | 0.45um | 500個 |
標簽：
凝膠過濾層析
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