PolySeq.AI利用3種質(zhì)譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)多克隆抗體從頭測(cè)序99%+準(zhǔn)確率

首個(gè)多克隆抗體從頭測(cè)序軟件！PolySeq.AI利用3種質(zhì)譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)99%+準(zhǔn)確率

你有沒(méi)有想過(guò)：為什么有些抗體能對(duì)抗病毒突變，卻一直沒(méi)法大規(guī)模用在新藥里？答案源自多克隆抗體(pAb)”的特性，它能識(shí)別抗原的多個(gè)位點(diǎn)，比單克隆抗體(mAb)更抗突變，卻因?yàn)槌煞痔珡?fù)雜，一直面臨“測(cè)序難”的困境：要么依賴稀缺的B細(xì)胞，要么靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)“猜”，結(jié)果又慢又不準(zhǔn)，而且通過(guò)質(zhì)譜直接測(cè)序，數(shù)據(jù)又過(guò)于復(fù)雜幾乎無(wú)法拼接。但在我們Bioinformatics Solutions Inc.(BSI)研究團(tuán)隊(duì)的不斷努力下，這個(gè)卡脖子多年的難題終于迎來(lái)了重大突破！10月13日，題為“Sequencing of Polyclonal Antibodies by Integrating Intact Mass, Middle-Down and De Novo Bottom-Up Mass Spectrometry”的文章正式上線Molecular & Cellular Proteomics，將bottom-up、middle-down和intact mass質(zhì)譜技術(shù)“三招聯(lián)用”，實(shí)現(xiàn)了多克隆抗體的全自動(dòng)、無(wú)數(shù)據(jù)庫(kù)測(cè)序，準(zhǔn)確率高達(dá)99%+，開(kāi)啟多克隆抗體新藥研發(fā)的新紀(jì)元！

BSI團(tuán)隊(duì)的Lei Xin, Wenting Li , Shuyang Zhang 為共同第一作者，Baozhen Shan和Ming Li院士為本文通訊作者，該工作囊括了算法，軟件開(kāi)發(fā)，液相分離技術(shù)和質(zhì)譜多個(gè)小組的共同協(xié)作。

圖1 PolySeq.AI流程示意圖

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先搞懂：多克隆抗體為啥“好用卻難測(cè)”？
首先，要了解“單克隆”和“多克隆”的區(qū)別：
◆單克隆抗體(mAb)：成分單一，能精準(zhǔn)盯緊一個(gè)抗原位點(diǎn)，測(cè)序容易、批次穩(wěn)定，是現(xiàn)在很多抗癌藥、單抗藥的首選。
◆多克隆抗體(pAb)：是B細(xì)胞“批量生產(chǎn)”的混合抗體，能同時(shí)盯緊抗原的多個(gè)位點(diǎn)，這意味著它更能適應(yīng)病毒突變(比如新冠變異株)，還能檢測(cè)低濃度抗原，在抗蛇毒血清、ELISA檢測(cè)里非常適用。

圖2 單抗和多抗的結(jié)合示意

pAb的“混合性”在結(jié)合廣泛的同時(shí)，也帶來(lái)了硬傷，那就是成分復(fù)雜、批次差異大，想測(cè)清楚它的氨基酸序列，以前要么靠“查字典”(比對(duì)已知的B細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)，很多時(shí)候還查不到)，要么靠手動(dòng)拼接，不僅慢，還容易出錯(cuò)，直接限制了它在新藥里的應(yīng)用。
 

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PolySeq.AI的“破局秘訣”：三招質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用
PolySeq.AI的核心優(yōu)勢(shì)，就是真正的實(shí)現(xiàn)了不依賴任何外部數(shù)據(jù)庫(kù)，只靠質(zhì)譜數(shù)據(jù)完成多抗序列的解析和拼接，而且全程自動(dòng)化的從頭測(cè)序，將濕實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析有機(jī)結(jié)合。它的操作邏輯可以總結(jié)為“先拆后拼，層層驗(yàn)證”(圖3)。

圖3 結(jié)合intact mass、bottom-up、middle-down的pAb從頭測(cè)序分析流程

Step 1–樣本制備及三種質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集
先把抗體樣本進(jìn)行預(yù)處理(比如切糖、切開(kāi)鉸鏈區(qū)等)，然后用三種質(zhì)譜技術(shù)分別獲取關(guān)鍵信息：

◆Intact Mass：看抗體的整體分子量，大致確定有多少種抗體形式，指導(dǎo)后續(xù)實(shí)驗(yàn)方向及為后續(xù)算法拼接提供依據(jù)；
◆Middle-down：把抗體拆成20-30kDa的中等片段(比如輕鏈、Fc片段)，捕捉片段的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)信息；
◆Bottom-up：把抗體拆成更小的肽段，像拼圖的小碎片一樣，為后續(xù)拼接提供 “細(xì)節(jié)素材”。

Step 2–AI算法“智能拼圖”
拿到三種質(zhì)譜數(shù)據(jù)后，PolySeq.AI根據(jù)以下步驟完成拼接，整個(gè)過(guò)程無(wú)需借助任何數(shù)據(jù)庫(kù)，以前需要一個(gè)經(jīng)驗(yàn)豐富的專家花十天半個(gè)月都不一定能處理完的工作，現(xiàn)在只需幾小時(shí)就能搞定。
◆用bottom-up的多肽構(gòu)建“重疊圖庫(kù)”，先拼出初步序列；
◆用middle-down的片段信息“校準(zhǔn)”，篩選出最匹配的序列組裝路徑；
◆最后用intact mass數(shù)據(jù)“收尾”，把中等片段拼成完整的抗體鏈(輕鏈、重鏈)，最后還能自動(dòng)糾正氨基酸的錯(cuò)配問(wèn)題(比如區(qū)分亮氨酸Leu和異亮氨酸Ile，N和GG這類isobaric錯(cuò)誤)。

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硬核驗(yàn)證：兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果“實(shí)錘”準(zhǔn)確率
光說(shuō)不練假把式，我們的實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)用兩組不同的實(shí)驗(yàn)直接驗(yàn)證了PolySeq.AI的實(shí)力。

實(shí)驗(yàn)1：HB-95細(xì)胞系的抗體混合物
HB-95細(xì)胞系能產(chǎn)生針對(duì)HLA-I復(fù)合物的抗體，用單克隆抗體測(cè)序方法只能測(cè)出部分序列，但從intact mass的解卷積結(jié)果中，可以明確看到有3種組合形式(圖4)。用PolySeq.AI方案不僅準(zhǔn)確組裝出了3種完整的抗體形式(2種輕鏈+1種重鏈的組合)，并且與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，我們給出的序列與已知的抗體片段匹配率達(dá)到了100%。然后，我們把測(cè)序結(jié)果通過(guò)重組表達(dá)后，產(chǎn)物能精準(zhǔn)結(jié)合HLA-I復(fù)合物，足以證明準(zhǔn)確性。

圖4 HB95 intact mass解卷積的三種抗體組合

實(shí)驗(yàn)2：4種已知單抗的模擬混合液測(cè)序
我們把4種臨床常用的單抗：貝伐單抗(Avastin)、阿達(dá)木單抗(Humira)、利妥昔單抗(MabThera)和曲妥珠單抗(赫賽汀)，按3:2:1:1比例混合，模擬復(fù)雜的多克隆抗體環(huán)境，通過(guò)PolySeq.AI實(shí)現(xiàn)了超過(guò)99%的測(cè)序準(zhǔn)確率，含量低于5%的抗體也能準(zhǔn)確測(cè)定。其中，bottom-up的肽段覆蓋度達(dá)到100%，middle-down的片段匹配度也超過(guò)了50%。

圖5 四種抗體混合物的測(cè)定序列

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PolySeq.AI的突破，到底意味著什么？
PolySeq.AI的突破貢獻(xiàn)，不僅僅只是“測(cè)準(zhǔn)了序列”，更給生物醫(yī)藥領(lǐng)域帶來(lái)了兩個(gè)關(guān)鍵改變：
◆解決pAb的“批次難題”：以前pAb因?yàn)樾蛄胁磺澹�批次差異大，沒(méi)法大規(guī)模用于臨床；現(xiàn)在能精準(zhǔn)測(cè)序，就能通過(guò)重組技術(shù)批量生產(chǎn)“標(biāo)準(zhǔn)化”的pAb，使得抗蛇毒血清、抗病毒cocktail療法等都能更穩(wěn)定的應(yīng)用。
◆加速新藥研發(fā)：對(duì)于未知的抗體(比如新病毒的中和抗體），不用再花費(fèi)大量的時(shí)間和費(fèi)用成本尋找B細(xì)胞、建數(shù)據(jù)庫(kù)，關(guān)鍵是避免搜庫(kù)的偏向性，直接用PolySeq.AI測(cè)序，就能快速拿到序列，極大地加快了后續(xù)藥物的研發(fā)過(guò)程。

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從“測(cè)不準(zhǔn)”、“測(cè)不了”到“99%+準(zhǔn)確率”，PolySeq.AI靠“三招質(zhì)譜技術(shù)+AI拼圖”，終于把多克隆抗體的“密碼本”破譯了。這不僅是質(zhì)譜技術(shù)和AI結(jié)合的勝利，更讓我們看到，那些曾經(jīng)因?yàn)閺?fù)雜、難測(cè)而讓科學(xué)家們束手無(wú)策的生物大分子，未來(lái)真的有可能成為造福疾病患者的良藥。未來(lái)，我們會(huì)進(jìn)一步提升低豐度抗體的檢測(cè)靈敏度，甚至拓展到更復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物測(cè)序，為對(duì)抗傳染病、癌癥增添一把“精準(zhǔn)武器”。

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作為生物信息學(xué)的領(lǐng)軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物藥領(lǐng)域，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)和先進(jìn)算法提供世界領(lǐng)先的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)解決方案，以推進(jìn)生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過(guò)基于AI的計(jì)算方案，為您提供對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)的卓越洞見(jiàn)。旗下著名的PEAKS^®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學(xué)術(shù)和工業(yè)用戶，包括：PEAKS^®️ Studio，PEAKS^®️ Online，PEAKS^®️ GlycanFinder, PEAKS^®️ AB，ProteoformX^TM,DeepImmu^®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務(wù)和抗體綜合表征服務(wù)等。聯(lián)系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com